根系和叶片的酶液提取

研钵、离心管分别取0.5g材料于预冷的研钵中，先研磨成匀浆后加入3ml预冷的0.1mol/l PH7.0的磷酸缓冲液，倒入离心管，然后依次再加入3ml冲洗洗研钵倒入离心管，最后再用4ml冲洗研钵倒入离心管，10000rpm离心15分钟，取上清液定容至10ml后于4℃保存，上清液可用于测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、可溶性蛋白，丙二醛(MDA)、超氧阴离子自由基(O2-)产生速率采用分光光度计法。

根系可溶性蛋白含量的测定

测定所需试剂考马斯亮蓝、90%磷酸、乙醇、牛血清蛋白（BSA）。

采用考马斯亮蓝法。吸取样品提取液1.0ml放入玻璃试管中（每个样品重复两次）加入5ml配制的考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置两分钟后反应完成，在595nm比色，测定吸光度，并通过制作的标准曲线y=0.0024x 0.0288，R²=0.9835换算蛋白质含量。蛋白质含量计算可溶性蛋白含量（mg/g）=(C标准曲线换算值*VT提取液总体积)/（1000*W样品鲜重*V1测定时加样量）。

超氧化物歧化酶（SOD）测定

采用氮蓝四唑光化法。测定指标所需试剂为13mmol/L的甲硫氨基酸（Met）、75umol/L氮蓝四唑（NBT）、10umol/L乙二胺四乙酸（EDTA-Na2）、0.2umol/L核黄素、0.05mol/L磷酸缓冲液，加入以上试剂和样品酶液反应混合液体积为3.3ml，对照管不加酶液混匀后，用锡纸把两只对照管包裹住遮光，其他对照管和样品管置于4000lx日光等下反应25分钟,待反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应，以锡纸遮光管为调零管，分别在560nm下测定对照管CK1、CK2、CK3和样品管的OD值，计算SOD活性；结果计算以已知SOD活性单位抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位，酶活性以U·g-1Pro表示。计算公式：SOD总活性[U/g(FW)]=[(CK照光对照管-Ay样品管)*VT样品总体积]/（0.5*CK照光对照管*W样品鲜重*V1测定时样品用量）。

过氧化物酶（POD）活性的测定

采用愈创木酚法。测定加入所需试剂为0.05mol/L的愈创木酚、2%过氧化氢0.05mol/L PH5.5磷酸缓冲液，立即放入预先调好37℃的水浴锅中保温5分钟以上，向对照管中加入蒸馏水，其他样品加提取的酶液，反应混合液为5ml混匀，在470nm下用对照管调零，其他测定管加入测定所需试剂和提取酶液之后，立即计时测定，以每分钟读取一次，3min内吸光度变化值△A。以每分钟吸光度变化值，表示酶活性大小，即以△A470/[min·g(鲜重)] Pro表示，并按照酶活性（△A470·g-1FW·min-1）=（△A470吸光度（3min吸光度-初始吸光度）*酶提取液总量（ml））/（样品鲜重（g）*测定时酶液用量（ml）*3）计算酶的相对活性。

过氧化氢酶（CAT）活性的测定

采用紫外吸收法。测定所需试剂为0.2mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，0.1mol/L H2O2，此次将将粗酶液、PH7.8磷酸缓冲液和蒸馏水在25℃水浴中预热8min，再加入0.3mL的0.1mol/LH2O2，调零管不加提取的酶液，每加完1管立即计时，并倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度值，每隔1min 读数1次，共测4次。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U），酶活性以U•g-1FW· min-1表示。结果计算过氧化氢酶（CAT）活性（u/gFW/min）=(△A240*VT酶液总体积/（0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）*V1测定用样品提取酶液体积（ml）*t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）*FW样品鲜重）。

丙二醛(MDA)含量的测定

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定。所需试剂为10%的三氯乙酸(TCA)、0.5%的硫代巴比妥酸(TBA)和1mol/L的氢氧化钠；称取样品剪碎0.5g，加入0.5%TCA2ml和少量的石英砂，冰浴研磨成匀浆，再用2ml的TCA冲洗两次，定容至6mL，提取液4℃下离心（8000r）离心15分钟，然后取样品提取上清液2mL，加入3mL0.5%TBA溶液于试管中，沸水浴上反应15 min，再迅速冷却后4000 rpm离心15min，最后测定上清液于600nm，532nm和450nm下比色测定吸光值。并用公式计算MDA的含量，先计算MDA浓度C（umol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.560D450，再计算MDA含量（umol/gFW）=C为混合液中MDA浓度*V提取液体积/W样品鲜重。

超氧阴离子(O2-)的测定

采用羟胺氧化法略加修改。试剂，pH 7.8的磷酸缓冲液，盐酸羟胺溶液 (1mmol·L-1)，对氨基苯磺酸，a-萘胺。从对照和处理中随机选取若干叶片和根系各0.5g，在冰浴的研钵下加入适量的石英砂研磨成碎渣，加入2ml的pH 7.8的磷酸缓冲液，再继续研磨成匀浆后倒入离心管，用4ml的pH 7.8的磷酸缓冲液冲洗两次倒入离心管，加入缓冲液的最终体积为6ml配平离心(8000rpm)10 min。取上清液（酶液）1mL，加入0.5ml7.8PBS,1ml的盐酸羟胺溶液 (1mmol·L-1)摇匀，在25℃条件下保温1h;依次加入1ml17 mmol·L-1的对氨基苯磺酸，再加入7mmol•L-1a-萘胺1mL，混合后立即摇匀，在25℃下再反应20 min后离心（4000 rpm）5分钟后进行测定；结果计算先算出阴离子的含量，由测得的0D530，查制作的标准曲线换算出C浓度值，O2-产生速率（nmol/min/g）=（C为标准曲线查得的浓度*V为测定时所取提取液的用量）/（t反应时间*w样品鲜重）。

根系活力的测定

测定所需试剂为连二亚硫酸钠（保险粉）、0.4%TTC、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、配制的0.1mol/LPH7.0的缓冲液，1mol/L硫酸，称取根尖样品0.4g,放入玻璃试管中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液里，在37℃下暗保温4个小时，此后加入1mol/L硫酸终止反应，与此同时做一空白实验（不加样品根），其他同上步骤，然后把根尖取出，用吸水纸吸干水分后放入新的玻璃试管中，加入10ml的甲醇，盖上盖子放于37℃保温箱下避光静置5小时，然后用分光光度计在波长485nm下比色测定，以空白实验作参比调零，并制作标准曲线以0.4%TTC溶液的1ml放入50ml容量瓶中加入少量保险粉摇匀。在用乙酸乙酯或者丙酮定容，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00ml置于10ml容量瓶并用乙酸乙酯定容，以空白作为参比，然后在波长485nm下测定吸光度，绘制标准曲线。实验结果吸光值带入标准曲线y=0.0031x 0.0049，R²=0.9994求四氮唑还原量，然后计算TTC还原量（以鲜重计）并求出根活力大小，四氮唑还原强度（mg/(g.h)）=四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h）。

根系细胞质膜透性

首先取新鲜水稻叶片和根系0.5g,用自来水先冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后，用吸水纸吸干水分，水稻叶片样品用打孔取样，根系样品剪碎，（每个样品设置两个重复）放入试管中，加20ml去离子水，在室温下放置4h使叶片充分吸水后测定溶液电导率（R1）,然后再放入恒温水浴锅中100℃沸水浴中煮20分钟，以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率（R2），然后用公式计算质膜透性，用相对电导率表示，相对电导率（%）=R1处理电导率/R2煮沸电导率*100%。

硝酸还原酶

采用磺胺显色法测定。试剂，0.1mol·L-1的磷酸缓冲液 4ml（pH 7.5），0.2mol·L-1的 KNO3 5 mL，30%三氯乙酸，1%磺胺和 0.2% α-萘胺。将玉米叶片洗净，用打孔器打成 0.5～1cm 的圆片，混匀后称 3份，每份 0.5～1.0g，分别放入 50ml 的三角瓶中，加入试剂，0.1mol·L-1的磷酸缓冲液 4ml（pH 7.5）和 0.2mol·L-1的 KNO3 5 mL，摇匀，置于干燥器中，抽气 10 分钟，至真空。然后将三角瓶放入恒温箱，在 30℃暗条件下保温 30 分钟。取出后向 2、3 号瓶中各加入  l ml 30%三氯乙酸终止反应，将反应液离心（3000rpm  10min）或过滤。吸取 2ml 反应液于 3只试管中，各加入 4ml 1%磺胺和 0.2% α-萘胺。摇匀在 30℃水浴中保温 20 分钟。然后在520nm 波长下比色测定吸光值。 NR 活性（亚硝酸钠 μg/g 鲜重·h）＝亚硝酸钠微克数（μg）×稀释倍数/样品重（g）×时间（h）。 

谷氨酰胺合成酶(GS)活性的测定

采用考马斯亮蓝 G-250 测定。称取植物材料 1g 于研钵中，加 3ml 提取缓冲液，置于冰浴上研磨匀浆，转移至离心管中，4℃下 15000g 离心 20min，上清液即为粗酶液。取 1.6ml反应混合液 B，加入 0.7ml 粗酶液和 0.7ml ATP 溶液，混匀，于 37℃下保温 0.5h，加入显色剂 1ml，摇匀并放置片刻后，于 5000g 下离心 10min，取上清液，测定 540nm 处的吸光值，以加入 1.6ml 反应混合液 A 的为对照。吸取样品提取液 0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，充分混合，放置 2min 后，在 540nm 下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量，进而计算 GS 的活性。

根系和叶片的酶液提取

研钵、离心管分别取0.5g材料于预冷的研钵中，先研磨成匀浆后加入3ml预冷的0.1mol/l PH7.0的磷酸缓冲液，倒入离心管，然后依次再加入3ml冲洗洗研钵倒入离心管，最后再用4ml冲洗研钵倒入离心管，10000rpm离心15分钟，取上清液定容至10ml后于4℃保存，上清液可用于测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、可溶性蛋白，丙二醛(MDA)、超氧阴离子自由基(O2-)产生速率采用分光光度计法。

根系可溶性蛋白含量的测定

测定所需试剂考马斯亮蓝、90%磷酸、乙醇、牛血清蛋白（BSA）。

采用考马斯亮蓝法。吸取样品提取液1.0ml放入玻璃试管中（每个样品重复两次）加入5ml配制的考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置两分钟后反应完成，在595nm比色，测定吸光度，并通过制作的标准曲线y=0.0024x 0.0288，R²=0.9835换算蛋白质含量。蛋白质含量计算可溶性蛋白含量（mg/g）=(C标准曲线换算值*VT提取液总体积)/（1000*W样品鲜重*V1测定时加样量）。

超氧化物歧化酶（SOD）测定

采用氮蓝四唑光化法。测定指标所需试剂为13mmol/L的甲硫氨基酸（Met）、75umol/L氮蓝四唑（NBT）、10umol/L乙二胺四乙酸（EDTA-Na2）、0.2umol/L核黄素、0.05mol/L磷酸缓冲液，加入以上试剂和样品酶液反应混合液体积为3.3ml，对照管不加酶液混匀后，用锡纸把两只对照管包裹住遮光，其他对照管和样品管置于4000lx日光等下反应25分钟,待反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应，以锡纸遮光管为调零管，分别在560nm下测定对照管CK1、CK2、CK3和样品管的OD值，计算SOD活性；结果计算以已知SOD活性单位抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位，酶活性以U·g-1Pro表示。计算公式：SOD总活性[U/g(FW)]=[(CK照光对照管-Ay样品管)*VT样品总体积]/（0.5*CK照光对照管*W样品鲜重*V1测定时样品用量）。

过氧化物酶（POD）活性的测定

采用愈创木酚法。测定加入所需试剂为0.05mol/L的愈创木酚、2%过氧化氢0.05mol/L PH5.5磷酸缓冲液，立即放入预先调好37℃的水浴锅中保温5分钟以上，向对照管中加入蒸馏水，其他样品加提取的酶液，反应混合液为5ml混匀，在470nm下用对照管调零，其他测定管加入测定所需试剂和提取酶液之后，立即计时测定，以每分钟读取一次，3min内吸光度变化值△A。以每分钟吸光度变化值，表示酶活性大小，即以△A470/[min·g(鲜重)] Pro表示，并按照酶活性（△A470·g-1FW·min-1）=（△A470吸光度（3min吸光度-初始吸光度）*酶提取液总量（ml））/（样品鲜重（g）*测定时酶液用量（ml）*3）计算酶的相对活性。

过氧化氢酶（CAT）活性的测定

采用紫外吸收法。测定所需试剂为0.2mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，0.1mol/L H2O2，此次将将粗酶液、PH7.8磷酸缓冲液和蒸馏水在25℃水浴中预热8min，再加入0.3mL的0.1mol/LH2O2，调零管不加提取的酶液，每加完1管立即计时，并倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度值，每隔1min 读数1次，共测4次。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U），酶活性以U•g-1FW· min-1表示。结果计算过氧化氢酶（CAT）活性（u/gFW/min）=(△A240*VT酶液总体积/（0.1A240每下降0.1为1个酶活单位（u）*V1测定用样品提取酶液体积（ml）*t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）*FW样品鲜重）。

丙二醛(MDA)含量的测定

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定。所需试剂为10%的三氯乙酸(TCA)、0.5%的硫代巴比妥酸(TBA)和1mol/L的氢氧化钠；称取样品剪碎0.5g，加入0.5%TCA2ml和少量的石英砂，冰浴研磨成匀浆，再用2ml的TCA冲洗两次，定容至6mL，提取液4℃下离心（8000r）离心15分钟，然后取样品提取上清液2mL，加入3mL0.5%TBA溶液于试管中，沸水浴上反应15 min，再迅速冷却后4000 rpm离心15min，最后测定上清液于600nm，532nm和450nm下比色测定吸光值。并用公式计算MDA的含量，先计算MDA浓度C（umol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.560D450，再计算MDA含量（umol/gFW）=C为混合液中MDA浓度*V提取液体积/W样品鲜重。

超氧阴离子(O2-)的测定

采用羟胺氧化法略加修改。试剂，pH 7.8的磷酸缓冲液，盐酸羟胺溶液 (1mmol·L-1)，对氨基苯磺酸，a-萘胺。从对照和处理中随机选取若干叶片和根系各0.5g，在冰浴的研钵下加入适量的石英砂研磨成碎渣，加入2ml的pH 7.8的磷酸缓冲液，再继续研磨成匀浆后倒入离心管，用4ml的pH 7.8的磷酸缓冲液冲洗两次倒入离心管，加入缓冲液的最终体积为6ml配平离心(8000rpm)10 min。取上清液（酶液）1mL，加入0.5ml7.8PBS,1ml的盐酸羟胺溶液 (1mmol·L-1)摇匀，在25℃条件下保温1h;依次加入1ml17 mmol·L-1的对氨基苯磺酸，再加入7mmol•L-1a-萘胺1mL，混合后立即摇匀，在25℃下再反应20 min后离心（4000 rpm）5分钟后进行测定；结果计算先算出阴离子的含量，由测得的0D530，查制作的标准曲线换算出C浓度值，O2-产生速率（nmol/min/g）=（C为标准曲线查得的浓度*V为测定时所取提取液的用量）/（t反应时间*w样品鲜重）。

根系活力的测定

测定所需试剂为连二亚硫酸钠（保险粉）、0.4%TTC、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、配制的0.1mol/LPH7.0的缓冲液，1mol/L硫酸，称取根尖样品0.4g,放入玻璃试管中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液里，在37℃下暗保温4个小时，此后加入1mol/L硫酸终止反应，与此同时做一空白实验（不加样品根），其他同上步骤，然后把根尖取出，用吸水纸吸干水分后放入新的玻璃试管中，加入10ml的甲醇，盖上盖子放于37℃保温箱下避光静置5小时，然后用分光光度计在波长485nm下比色测定，以空白实验作参比调零，并制作标准曲线以0.4%TTC溶液的1ml放入50ml容量瓶中加入少量保险粉摇匀。在用乙酸乙酯或者丙酮定容，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00ml置于10ml容量瓶并用乙酸乙酯定容，以空白作为参比，然后在波长485nm下测定吸光度，绘制标准曲线。实验结果吸光值带入标准曲线y=0.0031x 0.0049，R²=0.9994求四氮唑还原量，然后计算TTC还原量（以鲜重计）并求出根活力大小，四氮唑还原强度（mg/(g.h)）=四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h）。

根系细胞质膜透性

首先取新鲜水稻叶片和根系0.5g,用自来水先冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后，用吸水纸吸干水分，水稻叶片样品用打孔取样，根系样品剪碎，（每个样品设置两个重复）放入试管中，加20ml去离子水，在室温下放置4h使叶片充分吸水后测定溶液电导率（R1）,然后再放入恒温水浴锅中100℃沸水浴中煮20分钟，以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率（R2），然后用公式计算质膜透性，用相对电导率表示，相对电导率（%）=R1处理电导率/R2煮沸电导率*100%。

硝酸还原酶

采用磺胺显色法测定。试剂，0.1mol·L-1的磷酸缓冲液 4ml（pH 7.5），0.2mol·L-1的 KNO3 5 mL，30%三氯乙酸，1%磺胺和 0.2% α-萘胺。将玉米叶片洗净，用打孔器打成 0.5～1cm 的圆片，混匀后称 3份，每份 0.5～1.0g，分别放入 50ml 的三角瓶中，加入试剂，0.1mol·L-1的磷酸缓冲液 4ml（pH 7.5）和 0.2mol·L-1的 KNO3 5 mL，摇匀，置于干燥器中，抽气 10 分钟，至真空。然后将三角瓶放入恒温箱，在 30℃暗条件下保温 30 分钟。取出后向 2、3 号瓶中各加入  l ml 30%三氯乙酸终止反应，将反应液离心（3000rpm  10min）或过滤。吸取 2ml 反应液于 3只试管中，各加入 4ml 1%磺胺和 0.2% α-萘胺。摇匀在 30℃水浴中保温 20 分钟。然后在520nm 波长下比色测定吸光值。 NR 活性（亚硝酸钠 μg/g 鲜重·h）＝亚硝酸钠微克数（μg）×稀释倍数/样品重（g）×时间（h）。 

谷氨酰胺合成酶(GS)活性的测定

采用考马斯亮蓝 G-250 测定。称取植物材料 1g 于研钵中，加 3ml 提取缓冲液，置于冰浴上研磨匀浆，转移至离心管中，4℃下 15000g 离心 20min，上清液即为粗酶液。取 1.6ml反应混合液 B，加入 0.7ml 粗酶液和 0.7ml ATP 溶液，混匀，于 37℃下保温 0.5h，加入显色剂 1ml，摇匀并放置片刻后，于 5000g 下离心 10min，取上清液，测定 540nm 处的吸光值，以加入 1.6ml 反应混合液 A 的为对照。吸取样品提取液 0.1ml（样品提取见各酶活测定），放入具塞刻度试管中（设两个重复管），加入 5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，充分混合，放置 2min 后，在 540nm 下比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量，进而计算 GS 的活性。