前  言

本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则   第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。

T/SDYZXCP 006.4《优质牛肉生产技术规程   疫病诊断和防治》分为如下部分：

——第 1 部分： 主要病毒性腹泻病；

——第 2 部分： 主要病毒性呼吸道病；

本文件是 T/SDYZXCP 006.4 的第 2 部分。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省优质畜产品协会提出并归口。

本文件起草单位：山东农业大学、滨州市农业农村局、滨州市滨城区农业农村综合服务中心、山东 福安清真食品集团股份有限公司、阳信万邦清真肉类有限公司、山东省畜产品质量安全中心。

本文件主要起草人： 商营利、王方昆、马文健、杜娟、杨金华、邹荣婕、马宗万、刘少宁、刘婕、 陈萌、林阳、苏亚昕、管凤。

优质牛肉生产技术规程

第 4 部分：疫病诊断和防治  主要病毒性呼吸道病

1  范围

本文件规定了肉牛主要病毒性呼吸道病传染性牛鼻气管炎、牛流行热、牛呼吸道合胞体病和牛副流感3型的流行病学、诊断和防治措施。

本文件适用于传染性牛鼻气管炎病毒（IBRV）、牛流行热病毒（BEFV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV） 和牛副流感病毒 3 型（BPIV-3）感染的诊断与防治。

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682    分析实验室用水规格和试验方法

GB 19489    实验室   生物安全通用要求

GB/T 27401    实验室质量控制规范   动物检疫

NY/ T 541    兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范

3  术语与定义

   本文件没有需要界定的术语和定义。

4  流行病学

4.1  传染源

患病肉牛和带毒肉牛。

4.2  易感动物

4.2.1  牛传染性鼻气管炎： 各年龄段的肉牛均可感染， 1  月～2  月的犊牛最容易感染， 肉牛比奶牛易感。

4.2.2  牛流行热： 多发于 3 岁～5 岁龄的牛，母牛（尤其是妊娠母牛）发病率要高于公牛。

4.2.3  牛呼吸道合胞体病： 多发于 1 月龄以上犊牛以及青年牛。

4.2.4  牛副流感 3 型： 多发于舍饲育肥牛。

4.3  传播途径

4.3.1  牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体病与牛副流感 3 型： 病毒通过呼吸道和接触被感染动物的 分泌物传播。

4.3.2  牛流行热： 病毒通过蚊、蠓、蝇等吸血性昆虫叮咬传播。

4.4  流行特点

4.4.1  牛传染性鼻气管炎： 一年四季均可发生， 尤其是秋季最为频繁。

4.4.2  牛流行热：夏末至秋初、蚊虫滋生的季节流行，具有周期性，每 6 年～8 年或 3 年～5 年流行一 次， 一次大流行后又常出现一次规模较小的流行。

4.4.3  牛呼吸道合胞体病： 冬季和初春季节多发， 晚秋也有不同程度的流行。

4.4.4  牛副流感 3 型： 一年四季均可发生， 多发于秋冬两季。

5  诊断

5.1  临床诊断

5.1.1  牛传染性鼻气管炎：呼吸道型感染的早期，病牛表现精神沉郁、体温高达 42 ℃,  随着疾病的发 展病牛呼吸加快、咳嗽不止、出现呼吸困难，有时伴有喘息等；结膜炎型的病牛会流大量眼泪，并且眼 结膜发红、充血、眼睑肿胀，且伴随脓性或者浆液性分泌物从鼻孔流出；流产型会导致妊娠母牛发生流 产； 脑膜脑炎型则以流鼻液、呼吸困难和共济失调等症状。

5.1.2  牛流行热：呼吸道型的病牛食欲降低，体温可达 40 ℃,  眼结膜潮红，呼吸急促， 口角出现大量 泡沫样黏液， 患病严重的牛可在发病后数小时内死亡； 胃肠型可见食欲废绝，体温可达 40 ℃,  病牛粪 便干燥，呈黄褐色， 胃肠蠕动减弱，反刍停止，部分牛还可出现腹泻和腹痛；瘫痪型的病例多数体温不 高， 四肢关节肿胀，疼痛， 卧地不起，肌肉颤抖，站立时后肢僵硬， 跛行。

5.1.3  牛呼吸道合胞体病： 急性发病期的病牛主要表现为严重的间质性肺炎，严重感染时还出现体温 升高、呼吸困难且急促、产奶量显著下降或废绝及妊娠母牛流产等。

5.1.4  牛副流感 3 型： 精神沉郁、食欲不振、流涕、流泪、发热和呼吸加快等症状。

5.2  实验室诊断

实验室病原核酸诊断方法按照附录 A 规定执行。

5.2.1  样品采集

5.2.1.1  鼻腔分泌物

将灭菌的棉拭子蘸取牛鼻腔分泌物放入含有 2 mL PBS 溶液的采样管中，2 ℃~8 ℃保存，尽快送 达实验室。

5.2.1.2  组织

采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结各 1 g ± 0.1 g，流产胎儿采集肝、肺、肾、脾 和胎盘组织各 1 g ± 0.1 g 。2 ℃~8 ℃保存，尽快送达实验室。

5.2.2  样品处理

5.2.2.1  鼻腔分泌物

采样管漩涡振荡 1 min， 12000 r/min 4 ℃离心 5 min，取上清液，-20 ℃以下保存备用。

5.2.2.2  组织

病料置于研钵，充分研磨后加 5 mL PBS 混匀， 12000 r/min 4 ℃离心 5 min，取上清液，-20 ℃以下 保存备用。

5.2.3  检测

按附录 A 的规定执行。

5.3  结果判定

5.3.1  可疑

符合 5.1 临床症状者，判定为可疑，进一步做实验室诊断。

5.3.2  确诊

实验室诊断为阳性者，判定为确诊。

6  防治措施

6.1  生物安全措施

6.1.1  消毒

发病肉牛污染的场所、用具、物品等彻底消毒。

6.1.1.1  杀灭传播媒介

溴氰菊酯类制剂，按产品使用说明书稀释，喷洒肉牛圈舍、运动场和排粪沟等环境设施，每周 2 次， 杀灭蚊、蝇、蠓等节肢动物。

6.1.1.2  环境设施

二氧化氯或过氧乙酸等消毒剂，按产品使用说明书规定浓度，对牛舍地面、食槽、车辆、对发病或 病死动物的排泄物和污染物进行消毒。

6.1.1.3  人员出入

人员需通过消毒通道， 靴鞋在消毒池中消毒。

6.1.1.4  车辆、工具

二氧化氯、过氧乙酸等等消毒剂， 按产品使用说明书规定浓度，对出入车辆、工具进行消毒。

6.1.2  病牛处理

发病肉牛禁止急宰销售； 经治疗痊愈后屠宰的肉牛产品， 需符合所用药物休药期的规定。

6.1.3  无害化处理

病死肉牛及污染物，按《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25 号）的规定执 行。

6.2  饲养管理

确保牧草供应充足，避免饲料发霉和变质，不得饲喂被化学药物污染的干草。选择高质量牧草和饲 料，要控制好牧草硬度，饲料应便于消化，做到蛋白质、维生素和矿物质等的科学搭配。可在饲料中添加微生物制剂调节胃肠道，或添加中草药以增强牛群免疫力。优化肉牛圈舍环境卫生情况，确保通风良好。

6.3  治疗

6.3.1  对症治疗

主要进行对症治疗，包括退热、缓解呼吸困难、强心、消炎镇痛、抗菌措施等。

6.3.2  特异性抗体治疗

发病初期若有相应的高免血清或卵黄抗体， 可用其对发病肉牛进行紧急治疗。

6.4  疫苗紧急接种

牛副流感病毒 3 型、牛呼吸道合胞体病毒、传染性牛鼻气管炎病毒和牛流行热病毒均可进行疫苗紧 急预防接种，疫苗使用按产品说明书进行。

6.5  疫情处置

如发现疑似疫情，应及时向当地兽医部门报告， 并采取隔离、消毒等生物安全措施防止疫情扩散。 同时，采样进行病原学检测确诊。

附  录 A

（规范性）

传染性牛鼻气管炎病毒、牛流行热病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒 3 型的测定

A.1  原理

以拟扩增的 DNA  分子为模板， 一对分别与模板  5'末端和 3'末端互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA 合成，重复这一过 程， 即可使目的 DNA 片段得到扩增。

A.2  试剂或材料

除非另有说明，仅使用分析纯试剂，所用液体试剂均需使用无 DNA/RNAase 的容器进行分装。 A.2.1  水： GB/T 6682， 一级。

A.2.2  酚-氯仿溶液： 配制方法见附录 B ，2 ℃~8 ℃保存。

A.2.3  氯仿-异戊醇溶液： 配制方法见附录 B ，2 ℃~8 ℃保存。

A.2.4  0.1% DEPC 水： 配制方法见附录 B。

A.2.5  无水乙醇： -20 ℃预冷。

A.2.6  75%乙醇； 配制方法见附录 B ，-20 ℃预冷。

A.2.7  TE 缓冲液； 配制方法见附录 B ，4 ℃保存。

A.2.8  2 mol/LNaAc 溶液； 配制方法见附录 B。

A.2.9  1%溴化乙锭（EB）溶液或等效核酸染料。

A.2.10  6×上样缓冲液； 配制方法见附录 B。

A.2.11  核酸分子量标准； 分子量范围 200 bp～2000 bp。

A.2.12  TAE 电泳缓冲液； 配制方法见附录 B。

A.2.13  PCR/RT-PCR 的阳性、阴性对照：

a ） 阳性对照： 分别为带有 IBRV 的 TK 基因、BEFV 的 G 基因、BRSV 的 G  基因和 BPIV-3 的 N 基因的质粒。

b）  阴性对照： 取已知阴性的同类样品作为阴性对照。

c ） 空白对照： 在扩增反应阶段设置。以无 DNA/RNAase 水作为模板设置空白对照。 A.2.14  Real-time PCR 阳性、阴性对照：

a ） 阳性对照： 分别为带有 IBRV 的 gB 基因、BEFV 的 G 基因、BRSV 的 N 基因和 BPIV-3 的 M 基因的质粒。

b）  阴性对照： 取已知阴性的同类样品作为阴性对照。

c ） 空白对照： 在扩增反应阶段设置。无 DNA/RNAase 水作为模板设置空白对照。 A.2.15  PCR/RT-PCR 的引物序列：

IBRV-F： 5′-AGACCCCAGTTGTGATGAATGC-3′

IBRV-R： 5′-ACACGTCCAGCACGAACACC-3′

BEFV-F： 5′-ATTTACAATGTTCCGGTGAA-3′

BEFV-R： 5′-GGTATCCATGTTCCGGTTAT-3′

BRSV-F： 5'-ACACATCAATYCAAAGCACCACAC-3'

BRSV-R： 5'-GCTRGTTCTGTGGTGGRTTGTTGTC-3'

BPIV-3-F： 5′-CTGGAGTTATGCGATGGGTGT-3′

BPIV-3-R： 5′-TGTCGTTTGCGATGTTGGTT-3′

A.2.16  Real-time PCR 的引物及探针序列：

IBRV-F： 5'-TGTGGACCTAAACCTCACGGT-3'

IBRV-R： 5'-GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC-3'

IBRV-P:    (FAM) 5′-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC-3′（BHQ1)

BEFV-F： 5'-GAGATCAAATGTCCACAACGTTTAA-3'

BEFV-R： 5'-AATGTTCATCCTTTGCAAGATTATGA-3'

BEFV-P:    (FAM)5'-AATTATCACTTCAAGCCC-3'（BHQ1)

BRSV-F： 5′-ATGCTGCAGGACTAGGTATAATGG-3′

BRSV-R： 5′-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCTC-3′

BRSV-P：（FAM）5′- ATGCTGCCAAAGCATATGCGGAACACA-3′（BHQ1）

BPIV-3-F： 5'-CAGGAACTCCTACAAGCCGC-3'

BPIV-3-R： 5'-CATGGGTACAGTTCAGGTTTAATG-3'

BPIV-3-P：（FAM）5'-CTATCATCTCCGTGGC-3'（BHQ1)

A.3  仪器设备

A.3.1  天平： 精度为 0.001 g。

A.3.2  普通 PCR 仪。

A.3.3  荧光 PCR 检测仪及配套反应管（板）。

A.3.4  高速冷冻离心机： 转速≥12000 r/min， 温度可达 4 ℃。

A.3.5  冰箱：2 ℃~8 ℃和-20 ℃以下。

A.3.6  Ⅱ级生物安全柜：A 型。

A.3.7  电热鼓风干燥箱。

A.3.8  电热恒温水槽。

A.3.9  涡旋振荡器。

A.3.10  凝胶成像仪。

A.3.11  水平电泳槽。

A.4  试验步骤

实验室应符合 GB 19489 和 GB/T 27401 要求， 实验过程中需使用无 DNA/RNAase 的耗材， 玻璃器 皿于 250 ℃干燥 4 h。操作者需带口罩和一次性手套，防止所用物品、空气和周围人员的 RNAase 污染。

A.4.1  RNA 和 DNA 提取

A.4.1.1  RNA 提取

A.4.1.1.1  在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，再加入 TRIzol 1 mL， 充分混匀， 室温放置 10 min。

A.4.1.1.2  加入 200 μL 的氯仿，盖紧离心管，用力震荡离心管至溶液充分乳化成乳白状，无分相现象， 室温放置 10 min。

A.4.1.1.3  12000 r/min 4 ℃离心 15 min，取上层液相移入另一 1.5 ml 离心管， 忌吸动白色中间相。

A.4.1.1.4  加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置 10 min。 A.4.1.1.5  12000 r/min 4 ℃离心 15 min，用移液器小心吸去所有上清液。

A.4.1.1.6  加 1 mL 75%乙醇洗一遍， 8000 r/min 4 ℃离心 10 min，用移液器小心吸去所有上清液，重 复此步骤，在超净台中干燥 5 min。

A.4.1.1.7  加入 50 μLTE 缓冲液溶解 RNA ，-20 ℃保存备用。

A.4.1.1.8  可采用商品试剂盒，按其使用说明书操作。

A.4.1.2  DNA 提取

A.4.1.2.1  在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，加入 450 μL 裂解缓冲液， 再加入 20 μL 蛋 白酶 K，充分混匀， 55 ℃ 15 min。

A.4.1.2.2  加入 700 μL 酚-氯仿溶液，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，使溶液充分乳化，成乳白状， 无分相现象， 室温放置 10 min。

A.4.1.2.3  12000 r/min 离心 15 min， 取上层液相移入另一管， 忌吸动白色中间相。

A.4.1.2.4  加入等体积氯仿-异戊醇溶液，轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置 10 min。 A.4.1.2.5  12000 r/min 离心 15 min， 取上清液相移入另一 1.5 ml 离心管。

A.4.1.2.6  加入 1/10 体积 2 mol/LNaAc 和等体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室 温放置 10 min。

A.4.1.2.7  12000 r/min 离心 5 min，用移液器吸去上清液，加 1 ml 75%乙醇洗一遍， 8000 r/min 离心 10 min， 用移液器吸去所有上清液，重复此步骤，在超净台中干燥 5 min。

A.4.1.2.8  加入 50 μLTE  缓冲液溶解 DNA ，-20 ℃保存备用。

A.4.1.2.9  采用商品试剂盒， 按照试剂盒使用说明书操作。

A.4.2  PCR/RT-PCR 扩增

A.4.2.1  PCR 扩增

A.4.2.1.1  反应体系配置

在试剂准备区，冰浴条件下按照下表分别将除模版 DNA 以外的各组分加入至 0.2 mL PCR 管，配 制反应体系。在样品制备区， 依次将待检样品的模板 DNA， 阳性对照和阴性对照加入配置好的反应体系，加完后盖紧盖子并做好标记。PCR 反应体系见表 A.1。

表A.1 PCR反应体系

A.4.2.1.2  扩增条件

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 95 ℃预变性 4 min；

b） 95 ℃变性 60 s， 58 ℃退火 45 s ，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环， 最后 72 ℃延伸 5 min。

A.4.2.2  RT-PCR 扩增

A.4.2.2.1  反应体系配置

在试剂准备区，冰浴条件下按照下表分别将除模版 RNA 以外的各组分加入至 0.2 mL PCR 管，配 制反应体系。在样品制备区， 依次将待检样品的模板 RNA， 阳性对照和阴性对照加入配置好的反应体 系，加完后盖紧盖子并做好标记。RT-PCR 反应体系见表 A. 2。

表 A.2 RT-PCR 反应体系

A.4.2.2.2  扩增条件

A.4.2.2.2.1  BEFV

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 37 ℃反转录  15 min， 85 ℃ 5 s ，4 ℃ 5 min；

b） 95 ℃预变性 4 min；

c ） 95 ℃变性 60 s， 50 ℃退火 45 s ，72 ℃延伸 53 s，共 35 个循环， 最后 72 ℃延 10 min。

A.4.2.2.2.2  BRSV

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 37 ℃反转录  15 min， 85 ℃ 5 s ，4 ℃ 5 min；

b） 94 ℃预变性 2 min；

c ） 94 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 30 s ，68 ℃延伸 40 s，共 40 个循环， 最后 68 ℃延伸 5 min。

A.4.2.2.2.3  BP IV-3

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 37 ℃反转录  15 min， 85 ℃ 5 s ，4 ℃ 5 min；

b） 95 ℃预变性 5 min；

c ） 95 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 60 s，共 35 个循环， 最后 72 ℃延 10 min。 采用商品化反转录试剂盒， 按照试剂盒使用说明书操作。

A.4.2.3  电泳

在产物分析区将 5 μL 的 6×上样缓冲液加入到 PCR/RT-PCR 产物中， 混匀后取 5  μL 加入到使用 1 ×TAE 电泳缓冲液配制的 1%琼脂糖凝胶中(含溴化乙锭溶液或等效核酸染料)，加核酸分子量标准作为电 泳参照物。调节电压 120 V， 电泳时间约 25 min。电泳结束后， 用凝胶成像仪观察结果并记录。

A.4.3  Real-time PCR 扩增

A.4.3.1  扩增试剂准备

在反应混合物配制区进行。设所需 PCR 管数为 n（ n=样本数 1 管阴性对照 2 管阳性对照）， 每个 测试反应体系需要 20 μL 荧光 Real-time PCR 反应液。根据所检测的病毒选择引物。配制反应液，为避 免移液器取样损失，建议按 n 1 个反应配制，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混 合均匀后， 向每个 PCR 管中各分装 20 μL，转移至样品处理区。

A.4.3.2  加样

在样品处理区进行。分别向上述 PCR 管中加入样本核酸提取步骤 A.4.2.1 中制备的 RNA 溶液 5 μL 和 A.4.2.2 中制备的 DNA 溶液 2 μL，盖紧管盖， 500 r/min 离心 30 s，转移至检测区。

A.4.3.3  Real-time PCR 反应

A.4.3.3.1  IBRV

将 IBRV PCR 管置于荧光定量 PCR 仪上进行 RT-PCR 扩增，扩增程序为：

a ） 50 ℃反转录 10 min；

b） 95 ℃预变性 2 min；

c ） 95 ℃变性 15 s ，60 ℃  退火 45 s，共 45 个循环。在每一个循环的 60 ℃延伸时收集荧光信号。

A.4.3.3.2  BEFV、BRSV 与 BP IV-3

将 BEFV 、BRSV 与 BPIV-3 PCR 管置于荧光定量 PCR 仪上进行 RT-PCR 扩增，扩增程序为：

a ）50 ℃反转录 10 min；

b）95 ℃预变性 10 min；

c ）95 ℃变性 15 s ，60℃  退火 60 s，共 40 个循环。在每一个循环的 60 ℃延伸时收集荧光信号。 Real-time PCR 反应体系见表 A.3。

表 A.3 Real-time PCR 反应体系

A.5  结果判定

A.5.1  PCR/RT-PCR 的结果判定

A.5.1.1  质控标准

IBRV 阳性对照出现 183 bp  目的条带、BEFV 阳性对照出现 523 bp  目的条带、BRSV 阳性对照出现 374 bp  目的条带和 BPIV-3 阳性对照出现 506 bp  目的条带，且 IBRV 、BEFV 、BRSV 和 BPIV-3 阴性对 照无相应条带， 实验成立。

A.5.1.2  结果判定

被检样品出现目的条带，判定为核酸阳性。被检样品无目的条带，判定为核酸阴性。

A.5.2  Real-time PCR 结果判定

A.5.2.1  Real-time PCR 结果分析条件的设定

阈值设定原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的 最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。

A.5.2.2  质控标准

A.5.2.2.1  IBRV

阴性对照和空白对照应无 Ct 值， 阳性对照的 Ct 值应≤30 且出现典型的扩增曲线， 如对照不满足 以上条件，此次实验视为无效。

A.5.2.2.2  BEFV

阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线， 阳性对照的 Ct 值应≤27， 并出现典型的扩增曲线。

A.5.2.2.3  BRSV 与 BP IV-3

阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线， 阳性对照的 Ct 值应≤28， 并出现典型的扩增曲线。

A.5.2.3  结果判定

A.5.2.3.1  IBRV

检测结果现无 Ct 值的反应判为阴性反应； 检测结果呈现 Ct 值≤35 且扩增曲线有明显的对数增长 期，判为阳性反应；对于 35<Ct 值<45 的样品，应进行重复试验，如果重复试验的 Ct 值<45，且曲线有 明显的对数增长期，判为阳性反应，否则判为阴性反应。必要时，对初次检测呈阳性反应的样品进行重 复检测。

A.5.2.3.2  BEFV

检测通道均无 Ct 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性； 若检测通道出现特征性扩增曲线， 且 Ct 值≤35，表示相应样品为阳性。

A.5.2.3.3  BRSV 与 BP IV-3

检测通道均无 Ct 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性； 若检测通道出现特征性扩增曲线， 且 Ct 值≤30，表示相应样品为阳性； 若检测通道 Ct 值 30～38 区间，且出现典型的扩增曲线的样品， 建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性， 否则判为阴性。

附  录  B

(资料性)

溶液配制

B.1  DEPC 水

将 DEPC 加入水中至终浓度为 0.1%， 充分混合均匀后作用 12 h 分装， 121 ℃±2 ℃高压灭菌 30 min， 冷却后 2 ℃~8 ℃保存备用。

B.2  酚-氯仿溶液

Tris-饱和酚有机相（下层溶液）50 mL 和氯仿 48 mL 混匀，2 ℃~8 ℃保存。

B.3  氯仿-异戊醇溶液

氯仿 48 mL 和异戊醇 2 mL 混匀，2 ℃~8 ℃保存。

B.4  0.5 mol/L Tris-HCl 溶液

6.055 g Tris-HCL，加入 80 mL 水，浓 HCl 调节 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL， 室温保存。

B.5  0.5 mol/L EDTA 溶液

18.61 gNa2EDTA·2H2O，加入 80 mL 水，10%的 NaOH 溶液，调节 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL， 室温保存。

B.6  75%乙醇

75 mL 无水乙醇，加入 25 mL DEPC 水。

B.7  TE 缓冲液

0.5 mL 的 10 mmol/LTris-HCl (B.5) 、0.1 mL0.5 mol/L EDTA(B.4)加入到容量瓶中， 调 pH 8.0，加水 定容至 50 mL ，4 ℃保存。

B.8  2 mol/L NaAc 溶液

无水 NaAc： 16.4 g，加入约 40 mL 水搅拌溶解； 冰醋酸调节 pH 至 5.2，加水定容至 100 mL。

B.9  1×PBS 溶液

磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.24 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4   1.44 g， 氯化钠(NaCl) 8 g， 氯化钾(KCl) 0.2 g， 加水约 800 mL 充分搅拌溶解，浓 HCl 调 pH 至 7.4， 定容到 1 L。

B.10  6×上样缓冲液

EDTA 4.4 g，溴酚蓝 250 mg  ，二甲苯青 FF 250 mg，加水 200 mL 加热搅拌充分溶解，加入 180 mL 甘油，用 10%的 NaOH 调节 pH 至 7.0， 用水定容至 500 mL， 室温保存。

B.11  TAE 电泳缓冲液

Na2EDTA·2H2O 0.744 g ，Tris 碱  4.84 g，加水 800 mL， 充分搅拌溶解，然后加入 1.142 mL 醋酸， 充分搅拌，加浓 HCl 调 pH 至 8.5，加水定容至 1 L， 室温保存。

前  言

本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则   第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。

T/SDYZXCP 006.4《优质牛肉生产技术规程   疫病诊断和防治》分为如下部分：

——第 1 部分： 主要病毒性腹泻病；

——第 2 部分： 主要病毒性呼吸道病；

本文件是 T/SDYZXCP 006.4 的第 2 部分。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省优质畜产品协会提出并归口。

本文件起草单位：山东农业大学、滨州市农业农村局、滨州市滨城区农业农村综合服务中心、山东 福安清真食品集团股份有限公司、阳信万邦清真肉类有限公司、山东省畜产品质量安全中心。

本文件主要起草人： 商营利、王方昆、马文健、杜娟、杨金华、邹荣婕、马宗万、刘少宁、刘婕、 陈萌、林阳、苏亚昕、管凤。

优质牛肉生产技术规程

第 4 部分：疫病诊断和防治  主要病毒性呼吸道病

1  范围

本文件规定了肉牛主要病毒性呼吸道病传染性牛鼻气管炎、牛流行热、牛呼吸道合胞体病和牛副流感3型的流行病学、诊断和防治措施。

本文件适用于传染性牛鼻气管炎病毒（IBRV）、牛流行热病毒（BEFV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV） 和牛副流感病毒 3 型（BPIV-3）感染的诊断与防治。

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 6682    分析实验室用水规格和试验方法

GB 19489    实验室   生物安全通用要求

GB/T 27401    实验室质量控制规范   动物检疫

NY/ T 541    兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范

3  术语与定义

   本文件没有需要界定的术语和定义。

4  流行病学

4.1  传染源

患病肉牛和带毒肉牛。

4.2  易感动物

4.2.1  牛传染性鼻气管炎： 各年龄段的肉牛均可感染， 1  月～2  月的犊牛最容易感染， 肉牛比奶牛易感。

4.2.2  牛流行热： 多发于 3 岁～5 岁龄的牛，母牛（尤其是妊娠母牛）发病率要高于公牛。

4.2.3  牛呼吸道合胞体病： 多发于 1 月龄以上犊牛以及青年牛。

4.2.4  牛副流感 3 型： 多发于舍饲育肥牛。

4.3  传播途径

4.3.1  牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体病与牛副流感 3 型： 病毒通过呼吸道和接触被感染动物的 分泌物传播。

4.3.2  牛流行热： 病毒通过蚊、蠓、蝇等吸血性昆虫叮咬传播。

4.4  流行特点

4.4.1  牛传染性鼻气管炎： 一年四季均可发生， 尤其是秋季最为频繁。

4.4.2  牛流行热：夏末至秋初、蚊虫滋生的季节流行，具有周期性，每 6 年～8 年或 3 年～5 年流行一 次， 一次大流行后又常出现一次规模较小的流行。

4.4.3  牛呼吸道合胞体病： 冬季和初春季节多发， 晚秋也有不同程度的流行。

4.4.4  牛副流感 3 型： 一年四季均可发生， 多发于秋冬两季。

5  诊断

5.1  临床诊断

5.1.1  牛传染性鼻气管炎：呼吸道型感染的早期，病牛表现精神沉郁、体温高达 42 ℃,  随着疾病的发 展病牛呼吸加快、咳嗽不止、出现呼吸困难，有时伴有喘息等；结膜炎型的病牛会流大量眼泪，并且眼 结膜发红、充血、眼睑肿胀，且伴随脓性或者浆液性分泌物从鼻孔流出；流产型会导致妊娠母牛发生流 产； 脑膜脑炎型则以流鼻液、呼吸困难和共济失调等症状。

5.1.2  牛流行热：呼吸道型的病牛食欲降低，体温可达 40 ℃,  眼结膜潮红，呼吸急促， 口角出现大量 泡沫样黏液， 患病严重的牛可在发病后数小时内死亡； 胃肠型可见食欲废绝，体温可达 40 ℃,  病牛粪 便干燥，呈黄褐色， 胃肠蠕动减弱，反刍停止，部分牛还可出现腹泻和腹痛；瘫痪型的病例多数体温不 高， 四肢关节肿胀，疼痛， 卧地不起，肌肉颤抖，站立时后肢僵硬， 跛行。

5.1.3  牛呼吸道合胞体病： 急性发病期的病牛主要表现为严重的间质性肺炎，严重感染时还出现体温 升高、呼吸困难且急促、产奶量显著下降或废绝及妊娠母牛流产等。

5.1.4  牛副流感 3 型： 精神沉郁、食欲不振、流涕、流泪、发热和呼吸加快等症状。

5.2  实验室诊断

实验室病原核酸诊断方法按照附录 A 规定执行。

5.2.1  样品采集

5.2.1.1  鼻腔分泌物

将灭菌的棉拭子蘸取牛鼻腔分泌物放入含有 2 mL PBS 溶液的采样管中，2 ℃~8 ℃保存，尽快送 达实验室。

5.2.1.2  组织

采集动物呼吸道粘膜、扁桃腺、肺部和支气管淋巴结各 1 g ± 0.1 g，流产胎儿采集肝、肺、肾、脾 和胎盘组织各 1 g ± 0.1 g 。2 ℃~8 ℃保存，尽快送达实验室。

5.2.2  样品处理

5.2.2.1  鼻腔分泌物

采样管漩涡振荡 1 min， 12000 r/min 4 ℃离心 5 min，取上清液，-20 ℃以下保存备用。

5.2.2.2  组织

病料置于研钵，充分研磨后加 5 mL PBS 混匀， 12000 r/min 4 ℃离心 5 min，取上清液，-20 ℃以下 保存备用。

5.2.3  检测

按附录 A 的规定执行。

5.3  结果判定

5.3.1  可疑

符合 5.1 临床症状者，判定为可疑，进一步做实验室诊断。

5.3.2  确诊

实验室诊断为阳性者，判定为确诊。

6  防治措施

6.1  生物安全措施

6.1.1  消毒

发病肉牛污染的场所、用具、物品等彻底消毒。

6.1.1.1  杀灭传播媒介

溴氰菊酯类制剂，按产品使用说明书稀释，喷洒肉牛圈舍、运动场和排粪沟等环境设施，每周 2 次， 杀灭蚊、蝇、蠓等节肢动物。

6.1.1.2  环境设施

二氧化氯或过氧乙酸等消毒剂，按产品使用说明书规定浓度，对牛舍地面、食槽、车辆、对发病或 病死动物的排泄物和污染物进行消毒。

6.1.1.3  人员出入

人员需通过消毒通道， 靴鞋在消毒池中消毒。

6.1.1.4  车辆、工具

二氧化氯、过氧乙酸等等消毒剂， 按产品使用说明书规定浓度，对出入车辆、工具进行消毒。

6.1.2  病牛处理

发病肉牛禁止急宰销售； 经治疗痊愈后屠宰的肉牛产品， 需符合所用药物休药期的规定。

6.1.3  无害化处理

病死肉牛及污染物，按《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25 号）的规定执 行。

6.2  饲养管理

确保牧草供应充足，避免饲料发霉和变质，不得饲喂被化学药物污染的干草。选择高质量牧草和饲 料，要控制好牧草硬度，饲料应便于消化，做到蛋白质、维生素和矿物质等的科学搭配。可在饲料中添加微生物制剂调节胃肠道，或添加中草药以增强牛群免疫力。优化肉牛圈舍环境卫生情况，确保通风良好。

6.3  治疗

6.3.1  对症治疗

主要进行对症治疗，包括退热、缓解呼吸困难、强心、消炎镇痛、抗菌措施等。

6.3.2  特异性抗体治疗

发病初期若有相应的高免血清或卵黄抗体， 可用其对发病肉牛进行紧急治疗。

6.4  疫苗紧急接种

牛副流感病毒 3 型、牛呼吸道合胞体病毒、传染性牛鼻气管炎病毒和牛流行热病毒均可进行疫苗紧 急预防接种，疫苗使用按产品说明书进行。

6.5  疫情处置

如发现疑似疫情，应及时向当地兽医部门报告， 并采取隔离、消毒等生物安全措施防止疫情扩散。 同时，采样进行病原学检测确诊。

附  录 A

（规范性）

传染性牛鼻气管炎病毒、牛流行热病毒、牛呼吸道合胞体病毒和牛副流感病毒 3 型的测定

A.1  原理

以拟扩增的 DNA  分子为模板， 一对分别与模板  5'末端和 3'末端互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA 合成，重复这一过 程， 即可使目的 DNA 片段得到扩增。

A.2  试剂或材料

除非另有说明，仅使用分析纯试剂，所用液体试剂均需使用无 DNA/RNAase 的容器进行分装。 A.2.1  水： GB/T 6682， 一级。

A.2.2  酚-氯仿溶液： 配制方法见附录 B ，2 ℃~8 ℃保存。

A.2.3  氯仿-异戊醇溶液： 配制方法见附录 B ，2 ℃~8 ℃保存。

A.2.4  0.1% DEPC 水： 配制方法见附录 B。

A.2.5  无水乙醇： -20 ℃预冷。

A.2.6  75%乙醇； 配制方法见附录 B ，-20 ℃预冷。

A.2.7  TE 缓冲液； 配制方法见附录 B ，4 ℃保存。

A.2.8  2 mol/LNaAc 溶液； 配制方法见附录 B。

A.2.9  1%溴化乙锭（EB）溶液或等效核酸染料。

A.2.10  6×上样缓冲液； 配制方法见附录 B。

A.2.11  核酸分子量标准； 分子量范围 200 bp～2000 bp。

A.2.12  TAE 电泳缓冲液； 配制方法见附录 B。

A.2.13  PCR/RT-PCR 的阳性、阴性对照：

a ） 阳性对照： 分别为带有 IBRV 的 TK 基因、BEFV 的 G 基因、BRSV 的 G  基因和 BPIV-3 的 N 基因的质粒。

b）  阴性对照： 取已知阴性的同类样品作为阴性对照。

c ） 空白对照： 在扩增反应阶段设置。以无 DNA/RNAase 水作为模板设置空白对照。 A.2.14  Real-time PCR 阳性、阴性对照：

a ） 阳性对照： 分别为带有 IBRV 的 gB 基因、BEFV 的 G 基因、BRSV 的 N 基因和 BPIV-3 的 M 基因的质粒。

b）  阴性对照： 取已知阴性的同类样品作为阴性对照。

c ） 空白对照： 在扩增反应阶段设置。无 DNA/RNAase 水作为模板设置空白对照。 A.2.15  PCR/RT-PCR 的引物序列：

IBRV-F： 5′-AGACCCCAGTTGTGATGAATGC-3′

IBRV-R： 5′-ACACGTCCAGCACGAACACC-3′

BEFV-F： 5′-ATTTACAATGTTCCGGTGAA-3′

BEFV-R： 5′-GGTATCCATGTTCCGGTTAT-3′

BRSV-F： 5'-ACACATCAATYCAAAGCACCACAC-3'

BRSV-R： 5'-GCTRGTTCTGTGGTGGRTTGTTGTC-3'

BPIV-3-F： 5′-CTGGAGTTATGCGATGGGTGT-3′

BPIV-3-R： 5′-TGTCGTTTGCGATGTTGGTT-3′

A.2.16  Real-time PCR 的引物及探针序列：

IBRV-F： 5'-TGTGGACCTAAACCTCACGGT-3'

IBRV-R： 5'-GTAGTCGAGCAGACCCGTGTC-3'

IBRV-P:    (FAM) 5′-AGGACCGCGAGTTCTTGCCGC-3′（BHQ1)

BEFV-F： 5'-GAGATCAAATGTCCACAACGTTTAA-3'

BEFV-R： 5'-AATGTTCATCCTTTGCAAGATTATGA-3'

BEFV-P:    (FAM)5'-AATTATCACTTCAAGCCC-3'（BHQ1)

BRSV-F： 5′-ATGCTGCAGGACTAGGTATAATGG-3′

BRSV-R： 5′-ACACTGTAATTGATGACCCCATTCTC-3′

BRSV-P：（FAM）5′- ATGCTGCCAAAGCATATGCGGAACACA-3′（BHQ1）

BPIV-3-F： 5'-CAGGAACTCCTACAAGCCGC-3'

BPIV-3-R： 5'-CATGGGTACAGTTCAGGTTTAATG-3'

BPIV-3-P：（FAM）5'-CTATCATCTCCGTGGC-3'（BHQ1)

A.3  仪器设备

A.3.1  天平： 精度为 0.001 g。

A.3.2  普通 PCR 仪。

A.3.3  荧光 PCR 检测仪及配套反应管（板）。

A.3.4  高速冷冻离心机： 转速≥12000 r/min， 温度可达 4 ℃。

A.3.5  冰箱：2 ℃~8 ℃和-20 ℃以下。

A.3.6  Ⅱ级生物安全柜：A 型。

A.3.7  电热鼓风干燥箱。

A.3.8  电热恒温水槽。

A.3.9  涡旋振荡器。

A.3.10  凝胶成像仪。

A.3.11  水平电泳槽。

A.4  试验步骤

实验室应符合 GB 19489 和 GB/T 27401 要求， 实验过程中需使用无 DNA/RNAase 的耗材， 玻璃器 皿于 250 ℃干燥 4 h。操作者需带口罩和一次性手套，防止所用物品、空气和周围人员的 RNAase 污染。

A.4.1  RNA 和 DNA 提取

A.4.1.1  RNA 提取

A.4.1.1.1  在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，再加入 TRIzol 1 mL， 充分混匀， 室温放置 10 min。

A.4.1.1.2  加入 200 μL 的氯仿，盖紧离心管，用力震荡离心管至溶液充分乳化成乳白状，无分相现象， 室温放置 10 min。

A.4.1.1.3  12000 r/min 4 ℃离心 15 min，取上层液相移入另一 1.5 ml 离心管， 忌吸动白色中间相。

A.4.1.1.4  加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置 10 min。 A.4.1.1.5  12000 r/min 4 ℃离心 15 min，用移液器小心吸去所有上清液。

A.4.1.1.6  加 1 mL 75%乙醇洗一遍， 8000 r/min 4 ℃离心 10 min，用移液器小心吸去所有上清液，重 复此步骤，在超净台中干燥 5 min。

A.4.1.1.7  加入 50 μLTE 缓冲液溶解 RNA ，-20 ℃保存备用。

A.4.1.1.8  可采用商品试剂盒，按其使用说明书操作。

A.4.1.2  DNA 提取

A.4.1.2.1  在 1.5 mL 的离心管中加入样品上清液 200 μL，加入 450 μL 裂解缓冲液， 再加入 20 μL 蛋 白酶 K，充分混匀， 55 ℃ 15 min。

A.4.1.2.2  加入 700 μL 酚-氯仿溶液，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，使溶液充分乳化，成乳白状， 无分相现象， 室温放置 10 min。

A.4.1.2.3  12000 r/min 离心 15 min， 取上层液相移入另一管， 忌吸动白色中间相。

A.4.1.2.4  加入等体积氯仿-异戊醇溶液，轻轻颠倒离心管充分混匀液体， 室温放置 10 min。 A.4.1.2.5  12000 r/min 离心 15 min， 取上清液相移入另一 1.5 ml 离心管。

A.4.1.2.6  加入 1/10 体积 2 mol/LNaAc 和等体积预冷的无水乙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室 温放置 10 min。

A.4.1.2.7  12000 r/min 离心 5 min，用移液器吸去上清液，加 1 ml 75%乙醇洗一遍， 8000 r/min 离心 10 min， 用移液器吸去所有上清液，重复此步骤，在超净台中干燥 5 min。

A.4.1.2.8  加入 50 μLTE  缓冲液溶解 DNA ，-20 ℃保存备用。

A.4.1.2.9  采用商品试剂盒， 按照试剂盒使用说明书操作。

A.4.2  PCR/RT-PCR 扩增

A.4.2.1  PCR 扩增

A.4.2.1.1  反应体系配置

在试剂准备区，冰浴条件下按照下表分别将除模版 DNA 以外的各组分加入至 0.2 mL PCR 管，配 制反应体系。在样品制备区， 依次将待检样品的模板 DNA， 阳性对照和阴性对照加入配置好的反应体系，加完后盖紧盖子并做好标记。PCR 反应体系见表 A.1。

表A.1 PCR反应体系

A.4.2.1.2  扩增条件

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 95 ℃预变性 4 min；

b） 95 ℃变性 60 s， 58 ℃退火 45 s ，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环， 最后 72 ℃延伸 5 min。

A.4.2.2  RT-PCR 扩增

A.4.2.2.1  反应体系配置

在试剂准备区，冰浴条件下按照下表分别将除模版 RNA 以外的各组分加入至 0.2 mL PCR 管，配 制反应体系。在样品制备区， 依次将待检样品的模板 RNA， 阳性对照和阴性对照加入配置好的反应体 系，加完后盖紧盖子并做好标记。RT-PCR 反应体系见表 A. 2。

表 A.2 RT-PCR 反应体系

A.4.2.2.2  扩增条件

A.4.2.2.2.1  BEFV

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 37 ℃反转录  15 min， 85 ℃ 5 s ，4 ℃ 5 min；

b） 95 ℃预变性 4 min；

c ） 95 ℃变性 60 s， 50 ℃退火 45 s ，72 ℃延伸 53 s，共 35 个循环， 最后 72 ℃延 10 min。

A.4.2.2.2.2  BRSV

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 37 ℃反转录  15 min， 85 ℃ 5 s ，4 ℃ 5 min；

b） 94 ℃预变性 2 min；

c ） 94 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 30 s ，68 ℃延伸 40 s，共 40 个循环， 最后 68 ℃延伸 5 min。

A.4.2.2.2.3  BP IV-3

在核酸扩增区将 PCR 管置 PCR 扩增仪上按如下条件扩增：

a ） 37 ℃反转录  15 min， 85 ℃ 5 s ，4 ℃ 5 min；

b） 95 ℃预变性 5 min；

c ） 95 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 60 s，共 35 个循环， 最后 72 ℃延 10 min。 采用商品化反转录试剂盒， 按照试剂盒使用说明书操作。

A.4.2.3  电泳

在产物分析区将 5 μL 的 6×上样缓冲液加入到 PCR/RT-PCR 产物中， 混匀后取 5  μL 加入到使用 1 ×TAE 电泳缓冲液配制的 1%琼脂糖凝胶中(含溴化乙锭溶液或等效核酸染料)，加核酸分子量标准作为电 泳参照物。调节电压 120 V， 电泳时间约 25 min。电泳结束后， 用凝胶成像仪观察结果并记录。

A.4.3  Real-time PCR 扩增

A.4.3.1  扩增试剂准备

在反应混合物配制区进行。设所需 PCR 管数为 n（ n=样本数 1 管阴性对照 2 管阳性对照）， 每个 测试反应体系需要 20 μL 荧光 Real-time PCR 反应液。根据所检测的病毒选择引物。配制反应液，为避 免移液器取样损失，建议按 n 1 个反应配制，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混 合均匀后， 向每个 PCR 管中各分装 20 μL，转移至样品处理区。

A.4.3.2  加样

在样品处理区进行。分别向上述 PCR 管中加入样本核酸提取步骤 A.4.2.1 中制备的 RNA 溶液 5 μL 和 A.4.2.2 中制备的 DNA 溶液 2 μL，盖紧管盖， 500 r/min 离心 30 s，转移至检测区。

A.4.3.3  Real-time PCR 反应

A.4.3.3.1  IBRV

将 IBRV PCR 管置于荧光定量 PCR 仪上进行 RT-PCR 扩增，扩增程序为：

a ） 50 ℃反转录 10 min；

b） 95 ℃预变性 2 min；

c ） 95 ℃变性 15 s ，60 ℃  退火 45 s，共 45 个循环。在每一个循环的 60 ℃延伸时收集荧光信号。

A.4.3.3.2  BEFV、BRSV 与 BP IV-3

将 BEFV 、BRSV 与 BPIV-3 PCR 管置于荧光定量 PCR 仪上进行 RT-PCR 扩增，扩增程序为：

a ）50 ℃反转录 10 min；

b）95 ℃预变性 10 min；

c ）95 ℃变性 15 s ，60℃  退火 60 s，共 40 个循环。在每一个循环的 60 ℃延伸时收集荧光信号。 Real-time PCR 反应体系见表 A.3。

表 A.3 Real-time PCR 反应体系

A.5  结果判定

A.5.1  PCR/RT-PCR 的结果判定

A.5.1.1  质控标准

IBRV 阳性对照出现 183 bp  目的条带、BEFV 阳性对照出现 523 bp  目的条带、BRSV 阳性对照出现 374 bp  目的条带和 BPIV-3 阳性对照出现 506 bp  目的条带，且 IBRV 、BEFV 、BRSV 和 BPIV-3 阴性对 照无相应条带， 实验成立。

A.5.1.2  结果判定

被检样品出现目的条带，判定为核酸阳性。被检样品无目的条带，判定为核酸阴性。

A.5.2  Real-time PCR 结果判定

A.5.2.1  Real-time PCR 结果分析条件的设定

阈值设定原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的 最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值。

A.5.2.2  质控标准

A.5.2.2.1  IBRV

阴性对照和空白对照应无 Ct 值， 阳性对照的 Ct 值应≤30 且出现典型的扩增曲线， 如对照不满足 以上条件，此次实验视为无效。

A.5.2.2.2  BEFV

阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线， 阳性对照的 Ct 值应≤27， 并出现典型的扩增曲线。

A.5.2.2.3  BRSV 与 BP IV-3

阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线， 阳性对照的 Ct 值应≤28， 并出现典型的扩增曲线。

A.5.2.3  结果判定

A.5.2.3.1  IBRV

检测结果现无 Ct 值的反应判为阴性反应； 检测结果呈现 Ct 值≤35 且扩增曲线有明显的对数增长 期，判为阳性反应；对于 35<Ct 值<45 的样品，应进行重复试验，如果重复试验的 Ct 值<45，且曲线有 明显的对数增长期，判为阳性反应，否则判为阴性反应。必要时，对初次检测呈阳性反应的样品进行重 复检测。

A.5.2.3.2  BEFV

检测通道均无 Ct 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性； 若检测通道出现特征性扩增曲线， 且 Ct 值≤35，表示相应样品为阳性。

A.5.2.3.3  BRSV 与 BP IV-3

检测通道均无 Ct 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性； 若检测通道出现特征性扩增曲线， 且 Ct 值≤30，表示相应样品为阳性； 若检测通道 Ct 值 30～38 区间，且出现典型的扩增曲线的样品， 建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性， 否则判为阴性。

附  录  B

(资料性)

溶液配制

B.1  DEPC 水

将 DEPC 加入水中至终浓度为 0.1%， 充分混合均匀后作用 12 h 分装， 121 ℃±2 ℃高压灭菌 30 min， 冷却后 2 ℃~8 ℃保存备用。

B.2  酚-氯仿溶液

Tris-饱和酚有机相（下层溶液）50 mL 和氯仿 48 mL 混匀，2 ℃~8 ℃保存。

B.3  氯仿-异戊醇溶液

氯仿 48 mL 和异戊醇 2 mL 混匀，2 ℃~8 ℃保存。

B.4  0.5 mol/L Tris-HCl 溶液

6.055 g Tris-HCL，加入 80 mL 水，浓 HCl 调节 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL， 室温保存。

B.5  0.5 mol/L EDTA 溶液

18.61 gNa2EDTA·2H2O，加入 80 mL 水，10%的 NaOH 溶液，调节 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL， 室温保存。

B.6  75%乙醇

75 mL 无水乙醇，加入 25 mL DEPC 水。

B.7  TE 缓冲液

0.5 mL 的 10 mmol/LTris-HCl (B.5) 、0.1 mL0.5 mol/L EDTA(B.4)加入到容量瓶中， 调 pH 8.0，加水 定容至 50 mL ，4 ℃保存。

B.8  2 mol/L NaAc 溶液

无水 NaAc： 16.4 g，加入约 40 mL 水搅拌溶解； 冰醋酸调节 pH 至 5.2，加水定容至 100 mL。

B.9  1×PBS 溶液

磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.24 g，磷酸氢二钠(Na2HPO4   1.44 g， 氯化钠(NaCl) 8 g， 氯化钾(KCl) 0.2 g， 加水约 800 mL 充分搅拌溶解，浓 HCl 调 pH 至 7.4， 定容到 1 L。

B.10  6×上样缓冲液

EDTA 4.4 g，溴酚蓝 250 mg  ，二甲苯青 FF 250 mg，加水 200 mL 加热搅拌充分溶解，加入 180 mL 甘油，用 10%的 NaOH 调节 pH 至 7.0， 用水定容至 500 mL， 室温保存。

B.11  TAE 电泳缓冲液

Na2EDTA·2H2O 0.744 g ，Tris 碱  4.84 g，加水 800 mL， 充分搅拌溶解，然后加入 1.142 mL 醋酸， 充分搅拌，加浓 HCl 调 pH 至 8.5，加水定容至 1 L， 室温保存。