1. 试验设计

品种为郑单958和先玉335，播种密度4000株/亩。施肥方案：纯N15kg/亩，P₂O₅：5kg/亩，K₂O：5kg/亩，采用缓释肥料，随播种一次性施入。试验设高温处理和自然温度对照，2个品种共4个处理，每处理3个重复，每重复1个小区，其中自然温度对照的小区60平米，温室内小区30平米。抽雄至散粉结束，每日13时至15时增温，温度设为38℃，处理期间，每日取雄穗、花丝、花粉进行调查。

2. 测定内容与方法

（1）玉米雌穗分化时期的划分及解剖观察

玉米的雌穗发育时期划分为：生长锥生长期、小穗分化期、小花分化期、性器官发育形成期4个时期。每个小区选取生长正常的玉米植株幼穗。取样时间定为隔天上午8:00进行取样，每个处理共取9个花芽用于结构切片（参照北京德元有限公司的方法）。包括石蜡切片和HE染色两个步骤。

（2）玉米胚乳细胞增殖及籽粒灌浆动态测定

取各部位 12-15 个籽粒固定于装有卡诺固定液(无水乙醇﹕冰醋酸﹕三氯甲烷=9∶3∶1)的青霉素瓶中 48 h，置 70% 乙醇溶液保存，到吐丝后 30d（胚乳细胞数已不能观察计数)结束此观察。参照张祖建等的水稻胚乳细胞分离与计数法和王晓燕等玉米胚乳细胞分离与计数法观察和计数胚乳细。从吐丝至成熟期每隔 3 d，取果穗上、中、下部籽粒各 200 粒放入 80℃烘箱中烘至恒重后称重， 测定籽粒增重动态。参照朱庆森等方法用 Richards方程拟合籽粒灌浆和胚乳细胞的增殖动态。

（3）玉米籽粒细胞微观结构观察

于授粉后5 d、10、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d、45 d、53d，割取果穗中部籽粒，一部分用1:3(冰醋酸：酒精)固定液进行固定，常规石蜡制片法制片观察；另一部分用2.5写戊二醛和2%俄酸双固定，经缓冲液漂洗、系列酒精脱水、环氧丙烷置换，用Epon-812渗透包埋。塑料包埋的材料先在半薄切片扣上切片，片厚2.0mm，BAS-TBO染色，DlympusBH-2显微镜观察、照相；然后用LKB-800型超薄切片扣切片，醋酸双氧铀-檬酸铅染色，JEM-200 EX型透射电镜观察、照相。

（4）籽粒充实期关健酶活性测定

称取样品0.5 g，加5 mL提取液(含100 mmol /L Tris-HC1, pH7.5, 8 mmo l / L MgCl), 2 mmol/L EDTA, 12.5%甘油，0.5%聚乙烯吡咯烷酮，50 mmol/L-基乙醇)，冰浴研磨。取30 mL匀浆液，加1.8 mL缓冲液，1 000 g离心，将沉淀用缓冲液悬浮后，用于束缚态淀粉合成酶活性的测定。其余匀浆液10 000g冷冻离心10 min，上清液用于蔗糖合成酶、可溶性淀粉合成酶和ADPG焦磷酸化酶活性的测定。

（5）花粉表面超微结构观察

用0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，2.5%戊二醛固定液预固定2h，磷酸缓冲液多次冲洗多余戊二醛，1%锇酸后固定2h，清洗3次，30%-40%-50%-70%-80%-900%乙醇梯度脱水，样品移入无水乙醇后再转入醋酸戊酯中，处理15分钟，取出样品放入干燥器中干燥，真空喷镀，扫描电镜观察，拍照。采用KY-EM-1型图像处理系统计算电子显微镜所观察到的视场面积。

1. 试验设计

品种为郑单958和先玉335，播种密度4000株/亩。施肥方案：纯N15kg/亩，P₂O₅：5kg/亩，K₂O：5kg/亩，采用缓释肥料，随播种一次性施入。试验设高温处理和自然温度对照，2个品种共4个处理，每处理3个重复，每重复1个小区，其中自然温度对照的小区60平米，温室内小区30平米。抽雄至散粉结束，每日13时至15时增温，温度设为38℃，处理期间，每日取雄穗、花丝、花粉进行调查。

2. 测定内容与方法

（1）玉米雌穗分化时期的划分及解剖观察

玉米的雌穗发育时期划分为：生长锥生长期、小穗分化期、小花分化期、性器官发育形成期4个时期。每个小区选取生长正常的玉米植株幼穗。取样时间定为隔天上午8:00进行取样，每个处理共取9个花芽用于结构切片（参照北京德元有限公司的方法）。包括石蜡切片和HE染色两个步骤。

（2）玉米胚乳细胞增殖及籽粒灌浆动态测定

取各部位 12-15 个籽粒固定于装有卡诺固定液(无水乙醇﹕冰醋酸﹕三氯甲烷=9∶3∶1)的青霉素瓶中 48 h，置 70% 乙醇溶液保存，到吐丝后 30d（胚乳细胞数已不能观察计数)结束此观察。参照张祖建等的水稻胚乳细胞分离与计数法和王晓燕等玉米胚乳细胞分离与计数法观察和计数胚乳细。从吐丝至成熟期每隔 3 d，取果穗上、中、下部籽粒各 200 粒放入 80℃烘箱中烘至恒重后称重， 测定籽粒增重动态。参照朱庆森等方法用 Richards方程拟合籽粒灌浆和胚乳细胞的增殖动态。

（3）玉米籽粒细胞微观结构观察

于授粉后5 d、10、15 d、20 d、25 d、30 d、35 d、45 d、53d，割取果穗中部籽粒，一部分用1:3(冰醋酸：酒精)固定液进行固定，常规石蜡制片法制片观察；另一部分用2.5写戊二醛和2%俄酸双固定，经缓冲液漂洗、系列酒精脱水、环氧丙烷置换，用Epon-812渗透包埋。塑料包埋的材料先在半薄切片扣上切片，片厚2.0mm，BAS-TBO染色，DlympusBH-2显微镜观察、照相；然后用LKB-800型超薄切片扣切片，醋酸双氧铀-檬酸铅染色，JEM-200 EX型透射电镜观察、照相。

（4）籽粒充实期关健酶活性测定

称取样品0.5 g，加5 mL提取液(含100 mmol /L Tris-HC1, pH7.5, 8 mmo l / L MgCl), 2 mmol/L EDTA, 12.5%甘油，0.5%聚乙烯吡咯烷酮，50 mmol/L-基乙醇)，冰浴研磨。取30 mL匀浆液，加1.8 mL缓冲液，1 000 g离心，将沉淀用缓冲液悬浮后，用于束缚态淀粉合成酶活性的测定。其余匀浆液10 000g冷冻离心10 min，上清液用于蔗糖合成酶、可溶性淀粉合成酶和ADPG焦磷酸化酶活性的测定。

（5）花粉表面超微结构观察

用0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，2.5%戊二醛固定液预固定2h，磷酸缓冲液多次冲洗多余戊二醛，1%锇酸后固定2h，清洗3次，30%-40%-50%-70%-80%-900%乙醇梯度脱水，样品移入无水乙醇后再转入醋酸戊酯中，处理15分钟，取出样品放入干燥器中干燥，真空喷镀，扫描电镜观察，拍照。采用KY-EM-1型图像处理系统计算电子显微镜所观察到的视场面积。