(一)肉眼鉴别
本病一般都在迟眠蚕(青头蚕)中开始出现,此后陆续发生时,则情况变化多样。病蚕鉴别的主要依据是:体壁紧张,体色乳白,体躯肿张,爬行不止。剪去尾角或腹足滴出的血液呈乳白色,均为本病的特征。
(二)显微镜检查
以上鉴别尚不能肯定时,可取病蚕的血液制成临时标本,用400倍以上的显微镜检查有无多角体存在。镜检时常遇到多角体与脂肪球混淆不易区别。可以用下列方法鉴别。
1、苏丹Ⅲ染色法
取蚕血一滴,涂抹于载玻片上,干燥后加苏丹Ⅲ染色剂(0.5 g苏丹Ⅲ溶于100 ml,95%的乙醇中,加入少许甘油)一滴,加盖玻片镜检。在视野中多角体不着色,脂肪球呈红色或橙黄色。
2、有机溶剂溶解法
取蚕血一滴,涂抹于载玻片上,干燥后,加一滴乙醇乙醚的等量混和液。放置片刻,待混合液蒸发后,加水一滴。盖上盖玻片镜检。视野中脂肪球因被溶解而消失。多角体则依然存在。
(三)血清学方法
荒川(1989)应用胶乳凝集反应诊断家蚕核型多角体病,检测灵敏度达0.9mg/ml。
(四)分子诊断
PCR又称聚合酶链反应(polymerase chain reaction)。利用PCR的方法,可在体外使基因组的某个部分在短时间内扩增几百万倍。从患病蚕血淋巴中抽提总DNA后,用根据病毒基因组序列设计的一对特异性引物在体外进行扩增,如果产物在琼脂糖凝胶电泳中有特异性条带,则可判定为本病。
荧光定量PCR(real-time PCR),是国际上公认的核酸分子定量的标准方法。它具有特异性高、灵敏、污染途径少等优点,但是对技术员的要求较高。从患病蚕血淋巴或中肠组织中抽提总RNA后,用根据病毒基因组序列设计的一对特异性引物在体外进行扩增,利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。也可能将扩增的产物在琼脂糖凝胶电泳中有特异性条带,则可判定为本病。
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,此方法可能检测病毒在宿主细胞内蛋白质的表达情况,需要特异性的抗病毒蛋白的特异性的抗体。它具有特异性高、灵敏、污染途径少等优点,但是对技术员的要求较高。从患病蚕血淋巴或中肠组织中抽提总蛋白后,经聚丙烯安凝胶电泳分离后,与特异性抗体结合,免疫荧光技术检测病毒蛋白表达与否,如果出现阳性特异性的蛋白条带,则可判定为本病。
江苏溧阳蚕科技小院
培养单位:苏州大学
联合培养单位:江苏苏豪蚕种有限公司
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(一)肉眼鉴别
本病一般都在迟眠蚕(青头蚕)中开始出现,此后陆续发生时,则情况变化多样。病蚕鉴别的主要依据是:体壁紧张,体色乳白,体躯肿张,爬行不止。剪去尾角或腹足滴出的血液呈乳白色,均为本病的特征。
(二)显微镜检查
以上鉴别尚不能肯定时,可取病蚕的血液制成临时标本,用400倍以上的显微镜检查有无多角体存在。镜检时常遇到多角体与脂肪球混淆不易区别。可以用下列方法鉴别。
1、苏丹Ⅲ染色法
取蚕血一滴,涂抹于载玻片上,干燥后加苏丹Ⅲ染色剂(0.5 g苏丹Ⅲ溶于100 ml,95%的乙醇中,加入少许甘油)一滴,加盖玻片镜检。在视野中多角体不着色,脂肪球呈红色或橙黄色。
2、有机溶剂溶解法
取蚕血一滴,涂抹于载玻片上,干燥后,加一滴乙醇乙醚的等量混和液。放置片刻,待混合液蒸发后,加水一滴。盖上盖玻片镜检。视野中脂肪球因被溶解而消失。多角体则依然存在。
(三)血清学方法
荒川(1989)应用胶乳凝集反应诊断家蚕核型多角体病,检测灵敏度达0.9mg/ml。
(四)分子诊断
PCR又称聚合酶链反应(polymerase chain reaction)。利用PCR的方法,可在体外使基因组的某个部分在短时间内扩增几百万倍。从患病蚕血淋巴中抽提总DNA后,用根据病毒基因组序列设计的一对特异性引物在体外进行扩增,如果产物在琼脂糖凝胶电泳中有特异性条带,则可判定为本病。
荧光定量PCR(real-time PCR),是国际上公认的核酸分子定量的标准方法。它具有特异性高、灵敏、污染途径少等优点,但是对技术员的要求较高。从患病蚕血淋巴或中肠组织中抽提总RNA后,用根据病毒基因组序列设计的一对特异性引物在体外进行扩增,利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。也可能将扩增的产物在琼脂糖凝胶电泳中有特异性条带,则可判定为本病。
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,此方法可能检测病毒在宿主细胞内蛋白质的表达情况,需要特异性的抗病毒蛋白的特异性的抗体。它具有特异性高、灵敏、污染途径少等优点,但是对技术员的要求较高。从患病蚕血淋巴或中肠组织中抽提总蛋白后,经聚丙烯安凝胶电泳分离后,与特异性抗体结合,免疫荧光技术检测病毒蛋白表达与否,如果出现阳性特异性的蛋白条带,则可判定为本病。
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