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黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究（一）

发布时间：2025-03-14

一、绪论

1.1 黄原胶及其研究历史

微生物代谢胶也称生物胶，是微生物在生长代谢过程中，在不同外部条件下产生的多糖。 他们通常可分为三大类：细胞壁多糖、细胞内多糖和细胞外多糖。微生物多糖的商品化生产主 要取决于：（1）该多糖的性质及应用价值；（2）提取工艺的可行性；（3）生产成本；（4）使用 安全性。细胞壁多糖和细胞内多糖由于提取难度大、成本高，开发的品种比较少。大规模工业 化生产的微生物代谢胶大多是细胞外多糖。由于微生物代谢胶不像植物胶那样易受气候及其他 因素的影响，国际上对多种微生物代谢胶的研究颇为热门。目前以商业化应用的主要有黄原胶、 结冷胶、凝胶多糖、葡聚糖和酵母多糖等，而迄今为止只有黄原胶和结冷胶被国际食品立法机 构允许广泛用作食品添加剂。

 黄原胶(Xanthan gum)亦称汉生胶，它是以碳水化合物为主要原料，用野油菜黄单胞杆菌， 经微生物有氧发酵制取的胞外多糖，其水溶液具有独特的流变特性—“剪切稀化”，剪切速率增 加,溶液的表观粘度明显下降；剪切速率减小，表观粘度恢复原状，是一种典型的假塑性流体。

黄原胶分子是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸构成的“五糖重复单 元”结构聚合体，相对分子质量在2×106～2×107[1]，所含乙酸和丙酮酸的比例取决于所用菌株和 发酵条件。黄原胶聚合物骨架结构类似于纤维素，但是黄原胶的独特性质在于每隔一个单元上 存在的由甘露糖醋酸盐、终端甘露糖单元以及两者之间的一个葡萄糖醛酸盐组成的三糖侧链。 侧链上的葡萄糖醛酸和丙酮酸群赋予了黄原胶负电荷。带负电荷的侧链之间以及侧链与聚合物 骨架之间的相互作用决定了黄原胶溶液的优良性质。黄原胶的分子结构见图1.1

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20世纪50年代中期，美国农业部北部研究中心在制定开发“有用的微生物调查”中Jeanes等 人发现了黄原胶，60年代Peoria实验室首先用微生物发酵法获得了黄原胶。1961年美国Kelco公司 首先采用野油菜黄单胞杆菌NRRLB-1459开始黄原胶的半工业化生产。其产品主要用于油田的钻 井泥桨配制及采油工艺过程。1963年正式工业化生产。此后研究发现，甘蓝黑腐病黄单胞杆菌、 锦葵黄单胞杆菌、胡萝卜黄单胞杆菌、木薯萎蔫病黄胞杆菌、美人蕉枯叶黄单胞杆菌等都能产 黄原胶[2]。美国经过多年毒理学实验，1969年食品与药物管理局（FDA）批准黄原胶作为食品添 加剂，其后欧洲各国相继批准黄原胶在食品工业中的应用。1975年黄原胶载入美国药典，并公 布了质量标准。1983年联合国世界卫生组织（WHO）和粮农组织（FAO）也批准黄原胶作为食 品工业用稳定剂、乳化剂、增稠剂。

目前，已有10多个国家和地区生产黄原胶，主要有美国、英国、法国、日本、俄罗斯、德 国和中国。国外主要生产厂家有美国的Kelco公司、Pfizer公司，法国的Rhone-Poulene 公司、 Nero-Rousselotsatia 公司等。其中美国 Kelco 公司是世界上最大的黄原胶生产厂，Rhone-Poulene 公司位居第二。随着市场的不断扩大，Miles公司和CecaSA公司也加入其生产行列，美国ADM 公司正在着手建设大规模黄原胶生产装置,发展势头良好。在美国和西欧约有30%～40%的黄原 胶用于石化行业。据统计,1975年用于钻井泥桨的黄原胶为1800吨，1980年就达到3000余吨。 根据世界石油组织估计，全球石油行业钻井和三次采油方面远期需要黄原胶 90～100 万吨，足 见其巨大的市场潜力。黄原胶工业化生产技术日趋完善，尤其是生物技术的发展使黄原胶的发 酵产率、糖转化率、发酵液胶浓度等指标大大提高，发酵周期明显缩短。目前，世界上黄原胶 生产的最高水平已达到50m3单罐发酵年产量200～240 吨；淀粉投料质量分数由4%～5%提高 到8%～9%；发酵黄原胶质量分数已达到5%左右；原料多糖转化率接近80%；发酵周期由72～ 96h 缩短为48～52h[2]。

 我国黄原胶研究起步于20世纪70年代末，主要研究单位有：南开大学、山东省食品发酵 研究所、无锡轻工大学、山东大学、中国农科院、上海化工研究院、四川省抗菌工业研究所、 郑州工业大学生化中心和河南省科学院生物所等。1979 年南开大学生物系首次分离得到一批黄 原胶菌株，并提纯鉴定了这种酸性多糖。1985年率先在国内研究食品级黄原胶，并于1986年通 过了食品级黄原胶产品和生产菌株的毒理学安全性试验。经国家有关部门病理学试验与毒性试验后，1988 年8月卫生部批准了食品级黄原胶的卫生标准，并被列入食品添加剂名单。黄原胶 发酵液属于高粘度的非牛顿型流体，国内前期试产黄原胶的几家工厂由于发酵设备（主要是溶 氧问题）和后提取工艺的问题，都没能形成规模生产。1992 年江苏金湖制药厂建成国内第一家 黄原胶生产厂，全国产量不足100吨，1993年以后，由于国内需求不断扩大，黄原胶价格持续 上扬。到2001年，全国产量迅猛增加,总产量已超过1.5万吨/年，其中山东中轩生物制品有限 公司产量最大,近1万吨/年，其他厂规模都较小。据国家轻工业局规划发展司1999年8月提出 的《食品生物工程标志性目标》预测,到2005年,我国食品黄原胶需求量将达到3万吨/年。而 据石油行业专家预测，在石油钻井和三次采油方面需要黄原胶10万吨/年以上。由此可见,国内 黄原胶仍具有巨大的潜在市场。国内大约有45%的黄原胶作为食品级销售，40%用于石油工业， 15%用于农药、饲料、日化、环保等行业。目前，我国黄原胶产量 50%以上出口，国际市场非 常广阔（10万吨/年以上），国内市场潜力很大。

1.2 黄原胶的理化性质及其应用[3]

黄原胶是性能较为优越的生物胶，具有独特的理化性质，集增稠、悬浮、分散、乳化、稳 定等性能于一身。

1.2.1 假塑流变性

黄原胶溶液是一种典型的假塑性流体,其溶液粘度随剪切速率的增加而明显降低。在高剪切 速率下,聚合体结构解聚为无规则线团结构,使粘度迅速降低；当剪切速率解除时,分子结构又恢复 到双螺旋网状聚合体状态,使溶液粘度瞬间恢复到最大。黄原胶的假塑性对食品工业有重要价值， 如作为食品添加剂，有利于改革泵送和灌注工艺，便于固形物的混合，可节省能源，提高工作 效率。同时，添加了黄原胶的食品在食用时口感细腻，有利于风味的释放。

1.2.2 增稠性

黄原胶具有良好的增稠性能,特别是在低质量浓度下具有很高的粘度。3×10-1g/L的黄原胶溶 液能产生0.09Pa·S的有效粘度,黄原胶溶液的粘度是同质量浓度下明胶的100倍。黄原胶用于 印染业，可控制桨的流变性质，防止染料迁移，使图纹清晰。搪瓷工业使用黄原胶作增稠剂， 使搪瓷表面涂膜均一。在石油工业中，黄原胶可用于调配钻井泥桨以增加其粘度和控制流变性 能并可作为驱油剂，提高采油率。

1.2.3 稳定性

黄原胶溶液在一定的温度范围内(-4℃～93℃)反复加热冷冻，其粘度几乎不受影响，10g/L 黄原胶溶液由25℃加热到120℃,其粘度仅降低3%。 黄原胶溶液对酸碱十分稳定,在pH5～10其粘度不受影响。能和许多盐溶液混溶,粘度不受影 响。它可以分别在100g/L KCl，100g/L NaCl，100g/L CaCl2和50g/L Na2CO3溶液中长期存放90d(25℃)，粘度几乎保持不变。由于此性质，在石油钻采工业中采用黄原胶作泥桨增稠剂和采油驱油 剂，可保证在特殊地带的正常钻探。黄原胶在强酸强碱条件下仍保持良好的增粘性，可广泛应 用于油漆、造纸、化妆品、医药和农药等方面。

许多酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和半纤维素等都不能使黄原胶降解。

1.2.4 悬浮性和乳化性

由于黄原胶理化性质稳定，因而具有良好的悬浮性和乳化性。10g/L 的黄原胶溶液具有约 5×10-4N/cm2 的承托力。黄原胶借助于水相的稠化作用，可降油相和水相的不相溶性，能使油脂 乳化在水中，因此它可在许多食品饮料中用作乳化剂和稳定剂。

1.2.5 与增稠剂的协效性

黄原胶可与大多数合成的或天然的增稠剂配伍，如和槐豆胶、瓜尔胶、卡拉胶及魔芋胶等 都能互溶，溶后使混合胶粘度显著提高。

1.3 黄原胶的生产

1.3.1 菌种

黄原胶发酵的菌种一般采用野油菜黄单胞杆菌（亦称甘蓝黑腐病黄单胞杆菌），此外菜豆黄 单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝卜黄单胞菌亦可作为发酵菌种。我国目前已开发的菌株有南开-01、 山大-152、农-008、农-005和L4。这些菌株一般呈杆状，革兰氏染色阴性，产荚膜，无芽抱，有 极生鞭毛，专性好氧[4]，生产菌株通常采用冷冻干燥保存。 优良的品种对于产品的得率和品质有着至关重要的影响。国外有报道，有人采用基因重组 技术将黄原胶生产菌中的产胶基因进行测序、分离、筛选并表达，但尚未见到重组菌种用于工 业化的报道。如果能采用基因工程的手段将黄原胶生产菌种中的产胶基因分离出，再导入新的 完整的菌株中，使其具有双产胶基因或更多的产胶基因并稳定遗传，将会使黄原胶的产量成倍、 成数倍的增长[5]。

 1.3.2 生产工艺

目前国内外都在黄原胶的发酵工艺方面开展了很多研究，以提高产量和质量，国内的研究 主要集中在培养基配方和工艺改进方面，而国外的研究热点则为黄原胶的发酵动力学和代谢网 络分析，从各个角度阐述黄原胶的高产机理，并在此基础上改进工艺，使产量得到提高[6]。 黄原胶发酵可以是分批发酵、半分批发酵或者连续发酵。在工业生产中，通常采用通气搅 拌发酵罐进行分批深层发酵。工业生产步骤如下：发酵，乙醇沉淀，第一次干燥，乙醇/水混合 物洗涤，干燥，碾磨，质量控制和分装。菌株接种于含有碳源、氮源和无机盐的营养培养基中 活化，经过生长，培养物可以接种于逐级放大的发酵罐中，从而达到工业化的规模。在整个发 酵过程中，要监测pH值、通气量、温度和搅拌状况。黄原胶的生产受到培养基组成、培养有条件(温度，pH值，溶氧量等)、反应器类型、操作方式(连续式或间歇式)等多方面因素的影响。

黄原胶的发酵培养基由碳源、氮源、无机盐等组成，发酵培养基的组成及发酵条件对黄原 胶的合成有很大影响。碳源是构成菌体、合成黄原胶骨架及提供能量的原料。由于黄原胶生产 菌是异养微生物，只能从有机物的氧化分解中获得细胞进行合成反应所需要的能量。通常用作 碳源的物质主要是糖类、脂肪、某些有机酸、醇类和烃类等，由于各种微生物所具有的酶系不 同，因此可利用的碳源也不同。野油菜黄单胞杆菌可产生蛋白酶、淀粉酶等[7]，其发酵培养基的 常用碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物，不同的黄原胶生产菌株对碳源要求不同。研究 表明较高的碳源浓度能够抑制细胞生长及黄原胶的产量，过高的浓度会使渗透压增大，抑制菌 体生长，影响产胶。从大批量生产的角度出发，各国研究者都在碳源种类的选择上进行了大量 研究。从生产上考虑,黄原胶发酵所用碳源多为玉米糖桨，但也有研究者提出了用于黄原胶生产 的其他一些价廉易得的碳源。例如，Yoo等在黄原胶发酵生产中加入废甜菜根作为蔗糖的补充， 在一定培养条件下，黄原胶产量比单纯的蔗糖发酵提高了约70%，具有较大的经济效益[8]。

氮源的种类和浓度对黄原胶的产量和质量都会产生显著的影响。李卫旗和饶恕通过正交实 验表明氮源对黄原胶的产量具有极其显著的影响，碳源次之[9]。氮源是合成菌体蛋白质、核酸等 含氮物质的原料，分为有机氮源和无机氮源。无机氮源有氨水、尿素、硫酸铵和氯化铵等。有 机氮源组成复杂，常含某些未知因子影响细胞生长。黄单胞杆菌一般容易利用有机氮源，如蛋 白胨、鱼粉、豆饼粉、谷糠、玉米桨等。生产中一般使用比较便宜的鱼粉和豆饼粉。氮源的用 量直接影响到细胞的生长，从而间接影响黄原胶的合成速率及最终产率。在氮源浓度较低时， 随着氮源浓度的增加，细胞浓度增加，黄原胶合成速率加快，黄原胶产率也相应增加。但是当 氮源浓度增加到一定程度时，黄原胶的产率却开始降低。这是因为细胞生长过快，使得用于细 胞生长及维持细胞生命的能量加大，用于合成黄原胶的能量反而减少，导致黄原胶产量下降[10]， 因此在生产中必须选择合适的氮源浓度。

无机盐是微生物维持生命活动不可缺少的物质，其主要功能为：（1）构成细胞成分；（2） 作为酶的组成部分；（3）激活或抑制酶的活力；（4）调节培养基的渗透压、pH和氧化还原电位。 微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐对微生物生长及代谢产物的合成影响却很大。向黄单 胞杆菌发酵培养基中加入无机盐，如铁、锰、锌的盐类，CaCO3,KH2PO4和MgSO4，对黄原胶 的合成有明显的促进作用。研究表明，最佳的无机盐是轻质碳酸钙，它可作为缓冲剂，调节发 酵过程的 pH，其解离出的 Ca2 可作为聚合酶的促进因子，提高聚合酶的活性,提高黄原胶的聚 合度和分子质量。

pH对微生物的影响主要是以下几个方面：（1）影响培养基某些组分及细胞中间代谢产物的 解离，不同程度地影响了细胞对这些物质的利用；（2） 改变细胞膜的通透性，影响细胞对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；（3）影响酶的活力和酶的生成；（4）影响氧的溶解和发酵液的 氧化还原电位。氧化还原电位的改变，关系到细胞内一系列氧化还原反应能否进行。发酵前期 如果pH偏低，细菌生长和糖耗快，但菌体容易衰老，表现在发酵进入中、后期时糖耗变慢，黄 原胶生成减少。如果pH偏高，则菌体增殖受到抑制，细胞代谢不活跃，不仅长菌和糖耗慢，黄 原胶生成量也少。黄单胞杆菌生长的最适pH值在6～7.5之间，而生产黄原胶的最适pH值范围 是在7～8。研究表明，黄原胶发酵培养基的起始pH控制在 7.2～7.5时，有利于初期的细胞生 长和后期的黄原胶合成。在发酵过程中，pH值会下降，但在整个工业发酵过程中，可以通过控 制pH接近中性，直到碳源耗尽。

发酵温度不仅影响黄原胶的产率,还能改变产品的结构组成。发酵前期和中期温度过高，细 胞容易衰老，进入发酵后期时，细胞活力降低，糖耗慢，黄原胶生成速率减慢。如发酵温度过 低，不仅长菌慢，发酵周期延长，而且细胞代谢缓慢，产胶率降低。研究指出，较高的温度可 提高黄原胶的产量，但降低了产品中丙酮酸的含量，因此,如需提高黄原胶产量，应选择温度在 31℃～33℃,而要增加丙酮酸含量就应选择温度范围在27℃～31℃。

种龄及接种量对黄原胶生产也有一定影响。种龄的长短关系到种子活力的强弱，影响下一 次增殖的适应期长短.接种量的多少则明显影响种子生长期的长短。由于分泌出的黄原胶包裹在 细胞的周围,妨碍了营养物质的运输，影响了菌种的生长，因此，接种阶段时除应增加细胞的浓 度外，还应尽量降低黄原胶的产量。

野油菜黄单胞杆菌为好氧细菌，所以氧气对于细菌生长和生产黄原胶来说是必需的。通常 发酵液中的溶氧浓度影响到黄原胶产生菌的生长速率、黄原胶的生成率以及黄原胶的质量。高 浓度细菌随着发酵的进行发酵液粘度不断增大，体积传质系数降低，造成供氧能力逐渐下降， 合成速率变慢，产率降低。充足的氧气供应是有效生产高聚物并获得高产率的前提条件，而溶 氧浓度的高低则与生物反应器的结构有着直接而重要的关系。可以通过搅拌培养基来提供氧气， 但是，在生产过程中，当培养基粘度增加时，氧气的供应就越来越困难。在很大程度上，搅拌 受到发酵罐形状、液体体积、搅拌方式和叶轮性质的影响。应用能够增加供氧的叶轮系统和结 构合适的反应器，可以提高黄单胞杆菌生产黄原胶的能力。传统的反应器为搅拌式反应器(STR), 大部分的反应都是通过这种反应器来完成的，但是这种反应器无法克服发酵后期粘度过高而带 来的氧和其他营养物质的传递、交换困难等难题。为增加传递到培养基中的氧气，研究者提出 了各种不同的反应器结构，如许平1990年提出用泵式静态混合循环反应器可增加氧气在高粘度 发酵液中的传递速率[11]，从而使黄原胶产量得到提高；而气升式反应器能有效解决发酵过程中 的通气和搅拌所带来的热量问题，适合连续培养生产黄原胶[12]。

1.3.3 分离提取

黄原胶分离提取的目的在于按产品质量规格的要求，将发酵液中的杂质不同程度地除去， 通过分离、纯化、干燥等手段获得成品。黄原胶发酵液中有菌体细胞、未消耗完的碳水化合物 和无机盐等杂质，此外发酵液中还存在大量的水分需要除去。黄原胶的分离纯化是个成本很高 的步骤，后处理占到整个生产成本的 50%。提取的主要步骤：细胞的沉淀，黄原胶的沉淀、脱 水、干燥、研磨。黄原胶发酵液具有较高的粘度，处理非常困难，其中菌体细胞的去除是提取 工艺的一大障碍。目前有多种方法可灭活发酵液中的菌体：酶法成本较高；化学试剂容易改变 pH值, 而降低产品中的丙酮酸含量；因此一般采取巴氏灭菌法，此法由于温度较高还可提高黄 原胶的溶解度,并在一定程度上降低了溶液的粘度，有利于随后的离心或过滤。由于黄原胶发酵 液的粘度很高，过滤前需要稀释（稀释剂一般为水、酒精或含低浓度盐的酒精），以利于菌体 细胞和杂质的去除和黄原胶的沉淀，常用的方法有离心法，过滤法，酶降解法，次氯酸盐氧化 法，过滤-超滤浓缩法。黄原胶的沉淀分离一般采用乙醇、异丙醇沉淀法，这种方法是利用黄原 胶在某些溶剂和某些条件下失稳凝聚而沉淀的原理，将黄原胶从发酵液中提取出来。溶剂沉淀 法工艺简单、产品质量高、大型化生产技术成熟，为目前国内采用的主要生产方法。但是该方 法溶剂用量大，需配置溶剂回收设备，回收成本较高使黄原胶总成本持高不下，相对商业价值 较低，限制了黄原胶的推广和应用。

1.4 研究内容及意义

到目前为止，世界上黄原胶均采用发酵法生产，一般采用的是间歇式的生产工艺，生产装 置最大可达到几十立方米。主要流程为：菌种-摇瓶--种子放大—发酵--后处理-烘干-粉碎--成 品包装。由于黄单胞杆菌体积很小、强度很低，黄原胶的发酵过程是一个比较典型的气液两相 混合生化反应过程。

黄原胶独特的化学结构为其提供了优良的使用性能，但也正是因为黄原胶的独特结构，黄 原胶在发酵过程中，随着发酵液中黄原胶的浓度逐渐增大，发酵液的流体性质也从牛顿型流体 转变为高度假塑性的非牛顿型流体，而且这种转变是在浓度很低的情况下发生的，这种特性导 致了整个发酵过程在黄原胶浓度很低的状态下就进入传质、传热的控制过程，使氧的传递非常 困难，反应器内分区现象严重，发酵过程的溶氧效率大幅下降，物料混合严重不均，生物热很 难及时移出，使反应器内存在很大的浓度和温度梯度，各点发酵程度严重不均，这些问题的存 在使得黄原胶产品分子量分布宽、丙酮酸含量低、产品质量不一致。要解决以上问题，必须从 混合工程角度出发进行深入的研究。

国内对黄原胶的研究主要集中在生物化学和食品应用等方面，对发酵工程、产品后处理和 动力学方面的研究很少。对挡板和气体分布器的影响则没有探讨。总的来说，基础性、机理性的研究很少，无法对黄原胶生产技术，特别是发酵技术的改进提供有价值的意见，使得国内发 酵工艺很不合理。如目前国内厂家多采用了多层直叶圆盘涡轮等不恰当的反应器内部构件，难 以满足黄原胶发酵过程中溶氧和传热、传质的需要。

国内黄原胶技术研究存在的问题正是我们需要研究的方向，很显然，要全面解决黄原胶生 产技术中存在的问题，首先应该从发酵工程的角度入手，并引用化学工程中处理高粘度体系的 成功方法，进行以下几方面的工作：

I、对现有的黄原胶发酵体系的培养基成分、操作工艺条件进行优化研究，并在一定的放大 水平上进行进一步的研究，以获得具有产业化价值的数据。

II、参照化学工程对中高粘、假塑性的非牛顿型流体体系的一系列有效研究方法，深入研 究反应器型式、内部构件等对发酵过程各参数以及产品性能的影响，开发适合高粘非牛顿流体 的高效新型机械搅拌式生物反应器。

III、在前面两项工作的基础上，对新型机械搅拌式生物反应器进行评价。

基于以上想法，本研究主要内容分为两部分：

（1）冷模部分

研究了不同桨型组合对搅拌功率P，氧传质系数KLa、气含率ε的影响，针对黄原胶发酵的特性，筛选出一组能够促进整体对流，提高气液混合效果的新型搅拌器，将其应用于黄原胶发酵。

（2）热模部分

结构因素及培养基（碳源、氮源、无机盐等）、发酵温度、周期、气量、转速等工艺因素对 黄原胶发酵的胶产率、丙酮酸含量等主要技术指标的影响，探讨各项技术指标与结构因素及工 艺因素之间的关系。

为完成以上研究内容，课题组采取先分别进行冷模和热模研究，然后根据两部分研究的初 步结果进行合并研究的方式，获得了对实际发酵体系有实用价值、而且对实际生产技术有一定 指导意义的研究数据和结论，确定了在实验条件范围内生物反应器的最佳桨型组合。


图文来源 | XG-101黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究

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黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究（一）

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一、绪论

1.1 黄原胶及其研究历史

微生物代谢胶也称生物胶，是微生物在生长代谢过程中，在不同外部条件下产生的多糖。 他们通常可分为三大类：细胞壁多糖、细胞内多糖和细胞外多糖。微生物多糖的商品化生产主 要取决于：（1）该多糖的性质及应用价值；（2）提取工艺的可行性；（3）生产成本；（4）使用 安全性。细胞壁多糖和细胞内多糖由于提取难度大、成本高，开发的品种比较少。大规模工业 化生产的微生物代谢胶大多是细胞外多糖。由于微生物代谢胶不像植物胶那样易受气候及其他 因素的影响，国际上对多种微生物代谢胶的研究颇为热门。目前以商业化应用的主要有黄原胶、 结冷胶、凝胶多糖、葡聚糖和酵母多糖等，而迄今为止只有黄原胶和结冷胶被国际食品立法机 构允许广泛用作食品添加剂。

 黄原胶(Xanthan gum)亦称汉生胶，它是以碳水化合物为主要原料，用野油菜黄单胞杆菌， 经微生物有氧发酵制取的胞外多糖，其水溶液具有独特的流变特性—“剪切稀化”，剪切速率增 加,溶液的表观粘度明显下降；剪切速率减小，表观粘度恢复原状，是一种典型的假塑性流体。

黄原胶分子是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸构成的“五糖重复单 元”结构聚合体，相对分子质量在2×106～2×107[1]，所含乙酸和丙酮酸的比例取决于所用菌株和 发酵条件。黄原胶聚合物骨架结构类似于纤维素，但是黄原胶的独特性质在于每隔一个单元上 存在的由甘露糖醋酸盐、终端甘露糖单元以及两者之间的一个葡萄糖醛酸盐组成的三糖侧链。 侧链上的葡萄糖醛酸和丙酮酸群赋予了黄原胶负电荷。带负电荷的侧链之间以及侧链与聚合物 骨架之间的相互作用决定了黄原胶溶液的优良性质。黄原胶的分子结构见图1.1

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20世纪50年代中期，美国农业部北部研究中心在制定开发“有用的微生物调查”中Jeanes等 人发现了黄原胶，60年代Peoria实验室首先用微生物发酵法获得了黄原胶。1961年美国Kelco公司 首先采用野油菜黄单胞杆菌NRRLB-1459开始黄原胶的半工业化生产。其产品主要用于油田的钻 井泥桨配制及采油工艺过程。1963年正式工业化生产。此后研究发现，甘蓝黑腐病黄单胞杆菌、 锦葵黄单胞杆菌、胡萝卜黄单胞杆菌、木薯萎蔫病黄胞杆菌、美人蕉枯叶黄单胞杆菌等都能产 黄原胶[2]。美国经过多年毒理学实验，1969年食品与药物管理局（FDA）批准黄原胶作为食品添 加剂，其后欧洲各国相继批准黄原胶在食品工业中的应用。1975年黄原胶载入美国药典，并公 布了质量标准。1983年联合国世界卫生组织（WHO）和粮农组织（FAO）也批准黄原胶作为食 品工业用稳定剂、乳化剂、增稠剂。

目前，已有10多个国家和地区生产黄原胶，主要有美国、英国、法国、日本、俄罗斯、德 国和中国。国外主要生产厂家有美国的Kelco公司、Pfizer公司，法国的Rhone-Poulene 公司、 Nero-Rousselotsatia 公司等。其中美国 Kelco 公司是世界上最大的黄原胶生产厂，Rhone-Poulene 公司位居第二。随着市场的不断扩大，Miles公司和CecaSA公司也加入其生产行列，美国ADM 公司正在着手建设大规模黄原胶生产装置,发展势头良好。在美国和西欧约有30%～40%的黄原 胶用于石化行业。据统计,1975年用于钻井泥桨的黄原胶为1800吨，1980年就达到3000余吨。 根据世界石油组织估计，全球石油行业钻井和三次采油方面远期需要黄原胶 90～100 万吨，足 见其巨大的市场潜力。黄原胶工业化生产技术日趋完善，尤其是生物技术的发展使黄原胶的发 酵产率、糖转化率、发酵液胶浓度等指标大大提高，发酵周期明显缩短。目前，世界上黄原胶 生产的最高水平已达到50m3单罐发酵年产量200～240 吨；淀粉投料质量分数由4%～5%提高 到8%～9%；发酵黄原胶质量分数已达到5%左右；原料多糖转化率接近80%；发酵周期由72～ 96h 缩短为48～52h[2]。

 我国黄原胶研究起步于20世纪70年代末，主要研究单位有：南开大学、山东省食品发酵 研究所、无锡轻工大学、山东大学、中国农科院、上海化工研究院、四川省抗菌工业研究所、 郑州工业大学生化中心和河南省科学院生物所等。1979 年南开大学生物系首次分离得到一批黄 原胶菌株，并提纯鉴定了这种酸性多糖。1985年率先在国内研究食品级黄原胶，并于1986年通 过了食品级黄原胶产品和生产菌株的毒理学安全性试验。经国家有关部门病理学试验与毒性试验后，1988 年8月卫生部批准了食品级黄原胶的卫生标准，并被列入食品添加剂名单。黄原胶 发酵液属于高粘度的非牛顿型流体，国内前期试产黄原胶的几家工厂由于发酵设备（主要是溶 氧问题）和后提取工艺的问题，都没能形成规模生产。1992 年江苏金湖制药厂建成国内第一家 黄原胶生产厂，全国产量不足100吨，1993年以后，由于国内需求不断扩大，黄原胶价格持续 上扬。到2001年，全国产量迅猛增加,总产量已超过1.5万吨/年，其中山东中轩生物制品有限 公司产量最大,近1万吨/年，其他厂规模都较小。据国家轻工业局规划发展司1999年8月提出 的《食品生物工程标志性目标》预测,到2005年,我国食品黄原胶需求量将达到3万吨/年。而 据石油行业专家预测，在石油钻井和三次采油方面需要黄原胶10万吨/年以上。由此可见,国内 黄原胶仍具有巨大的潜在市场。国内大约有45%的黄原胶作为食品级销售，40%用于石油工业， 15%用于农药、饲料、日化、环保等行业。目前，我国黄原胶产量 50%以上出口，国际市场非 常广阔（10万吨/年以上），国内市场潜力很大。

1.2 黄原胶的理化性质及其应用[3]

黄原胶是性能较为优越的生物胶，具有独特的理化性质，集增稠、悬浮、分散、乳化、稳 定等性能于一身。

1.2.1 假塑流变性

黄原胶溶液是一种典型的假塑性流体,其溶液粘度随剪切速率的增加而明显降低。在高剪切 速率下,聚合体结构解聚为无规则线团结构,使粘度迅速降低；当剪切速率解除时,分子结构又恢复 到双螺旋网状聚合体状态,使溶液粘度瞬间恢复到最大。黄原胶的假塑性对食品工业有重要价值， 如作为食品添加剂，有利于改革泵送和灌注工艺，便于固形物的混合，可节省能源，提高工作 效率。同时，添加了黄原胶的食品在食用时口感细腻，有利于风味的释放。

1.2.2 增稠性

黄原胶具有良好的增稠性能,特别是在低质量浓度下具有很高的粘度。3×10-1g/L的黄原胶溶 液能产生0.09Pa·S的有效粘度,黄原胶溶液的粘度是同质量浓度下明胶的100倍。黄原胶用于 印染业，可控制桨的流变性质，防止染料迁移，使图纹清晰。搪瓷工业使用黄原胶作增稠剂， 使搪瓷表面涂膜均一。在石油工业中，黄原胶可用于调配钻井泥桨以增加其粘度和控制流变性 能并可作为驱油剂，提高采油率。

1.2.3 稳定性

黄原胶溶液在一定的温度范围内(-4℃～93℃)反复加热冷冻，其粘度几乎不受影响，10g/L 黄原胶溶液由25℃加热到120℃,其粘度仅降低3%。 黄原胶溶液对酸碱十分稳定,在pH5～10其粘度不受影响。能和许多盐溶液混溶,粘度不受影 响。它可以分别在100g/L KCl，100g/L NaCl，100g/L CaCl2和50g/L Na2CO3溶液中长期存放90d(25℃)，粘度几乎保持不变。由于此性质，在石油钻采工业中采用黄原胶作泥桨增稠剂和采油驱油 剂，可保证在特殊地带的正常钻探。黄原胶在强酸强碱条件下仍保持良好的增粘性，可广泛应 用于油漆、造纸、化妆品、医药和农药等方面。

许多酶如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和半纤维素等都不能使黄原胶降解。

1.2.4 悬浮性和乳化性

由于黄原胶理化性质稳定，因而具有良好的悬浮性和乳化性。10g/L 的黄原胶溶液具有约 5×10-4N/cm2 的承托力。黄原胶借助于水相的稠化作用，可降油相和水相的不相溶性，能使油脂 乳化在水中，因此它可在许多食品饮料中用作乳化剂和稳定剂。

1.2.5 与增稠剂的协效性

黄原胶可与大多数合成的或天然的增稠剂配伍，如和槐豆胶、瓜尔胶、卡拉胶及魔芋胶等 都能互溶，溶后使混合胶粘度显著提高。

1.3 黄原胶的生产

1.3.1 菌种

黄原胶发酵的菌种一般采用野油菜黄单胞杆菌（亦称甘蓝黑腐病黄单胞杆菌），此外菜豆黄 单胞菌、锦葵黄单胞菌和胡萝卜黄单胞菌亦可作为发酵菌种。我国目前已开发的菌株有南开-01、 山大-152、农-008、农-005和L4。这些菌株一般呈杆状，革兰氏染色阴性，产荚膜，无芽抱，有 极生鞭毛，专性好氧[4]，生产菌株通常采用冷冻干燥保存。 优良的品种对于产品的得率和品质有着至关重要的影响。国外有报道，有人采用基因重组 技术将黄原胶生产菌中的产胶基因进行测序、分离、筛选并表达，但尚未见到重组菌种用于工 业化的报道。如果能采用基因工程的手段将黄原胶生产菌种中的产胶基因分离出，再导入新的 完整的菌株中，使其具有双产胶基因或更多的产胶基因并稳定遗传，将会使黄原胶的产量成倍、 成数倍的增长[5]。

 1.3.2 生产工艺

目前国内外都在黄原胶的发酵工艺方面开展了很多研究，以提高产量和质量，国内的研究 主要集中在培养基配方和工艺改进方面，而国外的研究热点则为黄原胶的发酵动力学和代谢网 络分析，从各个角度阐述黄原胶的高产机理，并在此基础上改进工艺，使产量得到提高[6]。 黄原胶发酵可以是分批发酵、半分批发酵或者连续发酵。在工业生产中，通常采用通气搅 拌发酵罐进行分批深层发酵。工业生产步骤如下：发酵，乙醇沉淀，第一次干燥，乙醇/水混合 物洗涤，干燥，碾磨，质量控制和分装。菌株接种于含有碳源、氮源和无机盐的营养培养基中 活化，经过生长，培养物可以接种于逐级放大的发酵罐中，从而达到工业化的规模。在整个发 酵过程中，要监测pH值、通气量、温度和搅拌状况。黄原胶的生产受到培养基组成、培养有条件(温度，pH值，溶氧量等)、反应器类型、操作方式(连续式或间歇式)等多方面因素的影响。

黄原胶的发酵培养基由碳源、氮源、无机盐等组成，发酵培养基的组成及发酵条件对黄原 胶的合成有很大影响。碳源是构成菌体、合成黄原胶骨架及提供能量的原料。由于黄原胶生产 菌是异养微生物，只能从有机物的氧化分解中获得细胞进行合成反应所需要的能量。通常用作 碳源的物质主要是糖类、脂肪、某些有机酸、醇类和烃类等，由于各种微生物所具有的酶系不 同，因此可利用的碳源也不同。野油菜黄单胞杆菌可产生蛋白酶、淀粉酶等[7]，其发酵培养基的 常用碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物，不同的黄原胶生产菌株对碳源要求不同。研究 表明较高的碳源浓度能够抑制细胞生长及黄原胶的产量，过高的浓度会使渗透压增大，抑制菌 体生长，影响产胶。从大批量生产的角度出发，各国研究者都在碳源种类的选择上进行了大量 研究。从生产上考虑,黄原胶发酵所用碳源多为玉米糖桨，但也有研究者提出了用于黄原胶生产 的其他一些价廉易得的碳源。例如，Yoo等在黄原胶发酵生产中加入废甜菜根作为蔗糖的补充， 在一定培养条件下，黄原胶产量比单纯的蔗糖发酵提高了约70%，具有较大的经济效益[8]。

氮源的种类和浓度对黄原胶的产量和质量都会产生显著的影响。李卫旗和饶恕通过正交实 验表明氮源对黄原胶的产量具有极其显著的影响，碳源次之[9]。氮源是合成菌体蛋白质、核酸等 含氮物质的原料，分为有机氮源和无机氮源。无机氮源有氨水、尿素、硫酸铵和氯化铵等。有 机氮源组成复杂，常含某些未知因子影响细胞生长。黄单胞杆菌一般容易利用有机氮源，如蛋 白胨、鱼粉、豆饼粉、谷糠、玉米桨等。生产中一般使用比较便宜的鱼粉和豆饼粉。氮源的用 量直接影响到细胞的生长，从而间接影响黄原胶的合成速率及最终产率。在氮源浓度较低时， 随着氮源浓度的增加，细胞浓度增加，黄原胶合成速率加快，黄原胶产率也相应增加。但是当 氮源浓度增加到一定程度时，黄原胶的产率却开始降低。这是因为细胞生长过快，使得用于细 胞生长及维持细胞生命的能量加大，用于合成黄原胶的能量反而减少，导致黄原胶产量下降[10]， 因此在生产中必须选择合适的氮源浓度。

无机盐是微生物维持生命活动不可缺少的物质，其主要功能为：（1）构成细胞成分；（2） 作为酶的组成部分；（3）激活或抑制酶的活力；（4）调节培养基的渗透压、pH和氧化还原电位。 微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐对微生物生长及代谢产物的合成影响却很大。向黄单 胞杆菌发酵培养基中加入无机盐，如铁、锰、锌的盐类，CaCO3,KH2PO4和MgSO4，对黄原胶 的合成有明显的促进作用。研究表明，最佳的无机盐是轻质碳酸钙，它可作为缓冲剂，调节发 酵过程的 pH，其解离出的 Ca2 可作为聚合酶的促进因子，提高聚合酶的活性,提高黄原胶的聚 合度和分子质量。

pH对微生物的影响主要是以下几个方面：（1）影响培养基某些组分及细胞中间代谢产物的 解离，不同程度地影响了细胞对这些物质的利用；（2） 改变细胞膜的通透性，影响细胞对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；（3）影响酶的活力和酶的生成；（4）影响氧的溶解和发酵液的 氧化还原电位。氧化还原电位的改变，关系到细胞内一系列氧化还原反应能否进行。发酵前期 如果pH偏低，细菌生长和糖耗快，但菌体容易衰老，表现在发酵进入中、后期时糖耗变慢，黄 原胶生成减少。如果pH偏高，则菌体增殖受到抑制，细胞代谢不活跃，不仅长菌和糖耗慢，黄 原胶生成量也少。黄单胞杆菌生长的最适pH值在6～7.5之间，而生产黄原胶的最适pH值范围 是在7～8。研究表明，黄原胶发酵培养基的起始pH控制在 7.2～7.5时，有利于初期的细胞生 长和后期的黄原胶合成。在发酵过程中，pH值会下降，但在整个工业发酵过程中，可以通过控 制pH接近中性，直到碳源耗尽。

发酵温度不仅影响黄原胶的产率,还能改变产品的结构组成。发酵前期和中期温度过高，细 胞容易衰老，进入发酵后期时，细胞活力降低，糖耗慢，黄原胶生成速率减慢。如发酵温度过 低，不仅长菌慢，发酵周期延长，而且细胞代谢缓慢，产胶率降低。研究指出，较高的温度可 提高黄原胶的产量，但降低了产品中丙酮酸的含量，因此,如需提高黄原胶产量，应选择温度在 31℃～33℃,而要增加丙酮酸含量就应选择温度范围在27℃～31℃。

种龄及接种量对黄原胶生产也有一定影响。种龄的长短关系到种子活力的强弱，影响下一 次增殖的适应期长短.接种量的多少则明显影响种子生长期的长短。由于分泌出的黄原胶包裹在 细胞的周围,妨碍了营养物质的运输，影响了菌种的生长，因此，接种阶段时除应增加细胞的浓 度外，还应尽量降低黄原胶的产量。

野油菜黄单胞杆菌为好氧细菌，所以氧气对于细菌生长和生产黄原胶来说是必需的。通常 发酵液中的溶氧浓度影响到黄原胶产生菌的生长速率、黄原胶的生成率以及黄原胶的质量。高 浓度细菌随着发酵的进行发酵液粘度不断增大，体积传质系数降低，造成供氧能力逐渐下降， 合成速率变慢，产率降低。充足的氧气供应是有效生产高聚物并获得高产率的前提条件，而溶 氧浓度的高低则与生物反应器的结构有着直接而重要的关系。可以通过搅拌培养基来提供氧气， 但是，在生产过程中，当培养基粘度增加时，氧气的供应就越来越困难。在很大程度上，搅拌 受到发酵罐形状、液体体积、搅拌方式和叶轮性质的影响。应用能够增加供氧的叶轮系统和结 构合适的反应器，可以提高黄单胞杆菌生产黄原胶的能力。传统的反应器为搅拌式反应器(STR), 大部分的反应都是通过这种反应器来完成的，但是这种反应器无法克服发酵后期粘度过高而带 来的氧和其他营养物质的传递、交换困难等难题。为增加传递到培养基中的氧气，研究者提出 了各种不同的反应器结构，如许平1990年提出用泵式静态混合循环反应器可增加氧气在高粘度 发酵液中的传递速率[11]，从而使黄原胶产量得到提高；而气升式反应器能有效解决发酵过程中 的通气和搅拌所带来的热量问题，适合连续培养生产黄原胶[12]。

1.3.3 分离提取

黄原胶分离提取的目的在于按产品质量规格的要求，将发酵液中的杂质不同程度地除去， 通过分离、纯化、干燥等手段获得成品。黄原胶发酵液中有菌体细胞、未消耗完的碳水化合物 和无机盐等杂质，此外发酵液中还存在大量的水分需要除去。黄原胶的分离纯化是个成本很高 的步骤，后处理占到整个生产成本的 50%。提取的主要步骤：细胞的沉淀，黄原胶的沉淀、脱 水、干燥、研磨。黄原胶发酵液具有较高的粘度，处理非常困难，其中菌体细胞的去除是提取 工艺的一大障碍。目前有多种方法可灭活发酵液中的菌体：酶法成本较高；化学试剂容易改变 pH值, 而降低产品中的丙酮酸含量；因此一般采取巴氏灭菌法，此法由于温度较高还可提高黄 原胶的溶解度,并在一定程度上降低了溶液的粘度，有利于随后的离心或过滤。由于黄原胶发酵 液的粘度很高，过滤前需要稀释（稀释剂一般为水、酒精或含低浓度盐的酒精），以利于菌体 细胞和杂质的去除和黄原胶的沉淀，常用的方法有离心法，过滤法，酶降解法，次氯酸盐氧化 法，过滤-超滤浓缩法。黄原胶的沉淀分离一般采用乙醇、异丙醇沉淀法，这种方法是利用黄原 胶在某些溶剂和某些条件下失稳凝聚而沉淀的原理，将黄原胶从发酵液中提取出来。溶剂沉淀 法工艺简单、产品质量高、大型化生产技术成熟，为目前国内采用的主要生产方法。但是该方 法溶剂用量大，需配置溶剂回收设备，回收成本较高使黄原胶总成本持高不下，相对商业价值 较低，限制了黄原胶的推广和应用。

1.4 研究内容及意义

到目前为止，世界上黄原胶均采用发酵法生产，一般采用的是间歇式的生产工艺，生产装 置最大可达到几十立方米。主要流程为：菌种-摇瓶--种子放大—发酵--后处理-烘干-粉碎--成 品包装。由于黄单胞杆菌体积很小、强度很低，黄原胶的发酵过程是一个比较典型的气液两相 混合生化反应过程。

黄原胶独特的化学结构为其提供了优良的使用性能，但也正是因为黄原胶的独特结构，黄 原胶在发酵过程中，随着发酵液中黄原胶的浓度逐渐增大，发酵液的流体性质也从牛顿型流体 转变为高度假塑性的非牛顿型流体，而且这种转变是在浓度很低的情况下发生的，这种特性导 致了整个发酵过程在黄原胶浓度很低的状态下就进入传质、传热的控制过程，使氧的传递非常 困难，反应器内分区现象严重，发酵过程的溶氧效率大幅下降，物料混合严重不均，生物热很 难及时移出，使反应器内存在很大的浓度和温度梯度，各点发酵程度严重不均，这些问题的存 在使得黄原胶产品分子量分布宽、丙酮酸含量低、产品质量不一致。要解决以上问题，必须从 混合工程角度出发进行深入的研究。

国内对黄原胶的研究主要集中在生物化学和食品应用等方面，对发酵工程、产品后处理和 动力学方面的研究很少。对挡板和气体分布器的影响则没有探讨。总的来说，基础性、机理性的研究很少，无法对黄原胶生产技术，特别是发酵技术的改进提供有价值的意见，使得国内发 酵工艺很不合理。如目前国内厂家多采用了多层直叶圆盘涡轮等不恰当的反应器内部构件，难 以满足黄原胶发酵过程中溶氧和传热、传质的需要。

国内黄原胶技术研究存在的问题正是我们需要研究的方向，很显然，要全面解决黄原胶生 产技术中存在的问题，首先应该从发酵工程的角度入手，并引用化学工程中处理高粘度体系的 成功方法，进行以下几方面的工作：

I、对现有的黄原胶发酵体系的培养基成分、操作工艺条件进行优化研究，并在一定的放大 水平上进行进一步的研究，以获得具有产业化价值的数据。

II、参照化学工程对中高粘、假塑性的非牛顿型流体体系的一系列有效研究方法，深入研 究反应器型式、内部构件等对发酵过程各参数以及产品性能的影响，开发适合高粘非牛顿流体 的高效新型机械搅拌式生物反应器。

III、在前面两项工作的基础上，对新型机械搅拌式生物反应器进行评价。

基于以上想法，本研究主要内容分为两部分：

（1）冷模部分

研究了不同桨型组合对搅拌功率P，氧传质系数KLa、气含率ε的影响，针对黄原胶发酵的特性，筛选出一组能够促进整体对流，提高气液混合效果的新型搅拌器，将其应用于黄原胶发酵。

（2）热模部分

结构因素及培养基（碳源、氮源、无机盐等）、发酵温度、周期、气量、转速等工艺因素对 黄原胶发酵的胶产率、丙酮酸含量等主要技术指标的影响，探讨各项技术指标与结构因素及工 艺因素之间的关系。

为完成以上研究内容，课题组采取先分别进行冷模和热模研究，然后根据两部分研究的初 步结果进行合并研究的方式，获得了对实际发酵体系有实用价值、而且对实际生产技术有一定 指导意义的研究数据和结论，确定了在实验条件范围内生物反应器的最佳桨型组合。


图文来源 | XG-101黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究

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