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黄单胞菌发酵生产黄原胶的研究（二）
发布时间：2025-03-17二、黄原胶发酵工艺的优化
2.1 前言
目前国内外研究学者都在黄原胶的发酵工艺方面开展了很多研究，以提高黄原胶的质量和 产品得率。黄原胶的生产受到多方面因素的影响，诸如原料的选择、原料的合理配比、菌种选 育、发酵工艺、后处理工艺、生产设备等，国内的研究主要集中在培养基配方和工艺改进方面。 不同的黄原胶生产菌株对培养基成分级发酵条件有着不同的要求，本文在三角瓶水平上针对 XG-101 黄单胞杆菌发酵培养基的成分配比进行了优化研究，并从工业生产的实际情况出发，考 察了淀粉液化程度对黄原胶产率的影响。以此为基础放大到 30L 机械搅拌式生物反应器上深层 培养，在此水平上对黄原胶的发酵条件进行优化，得到XG-101黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的最 佳工艺条件，为进一步研究黄原胶的发酵工程奠定基础。
2.2 实验材料与方法
2.2.1 菌种
菌种 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campests）XG-101，本实验室保存菌种。
2.2.2 实验仪器
全自动生物反应器MSJ-u3 B.E.MARUBISHICO.LTD.，JAPAN；
YS100 显微镜 日本尼康
DZF-6050 型真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司
DHG-9245 型鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司
LRH-250 型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司
YXQ-LS-50SII 型立式压力蒸气灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂
QYC-211型空气恒温振荡器 上海福玛实验设备有限公司
U-3400型分光光度计 上海分析仪器厂
2.2.3 培养基
菌种斜面培养基（g/L）：淀粉5.0，牛肉膏3.0，NaCl5.0，蛋白胨 10.0，琼脂 15.0～20.0，初 始pH值7.4。
菌种扩大培养基（g/L）：（NH4）2SO4 1g/L，MgSO4 0.12g/L，CaCO3 2g/L，酵母浸粉2.4g/L， 淀粉10.6g/L，葡萄糖2.1g/L，初始pH7.4。
发酵培养基（g/L）：淀粉40g/L，豆粉6g/L，CaCO3 2g/L，初始pH7.4。
2.2.4 实验方法
2.2.4.1 培养方法
斜面种子培养：接种针直接挑取菌种进行接种，28℃下生化培养箱中培养48h，取出放入冰 箱4℃保藏。
液体种子培养：每瓶摇瓶种子培养基接一环活化斜面菌种，置于200r/ min 恒温摇床，28℃ 恒温振荡培养26小时。
摇瓶发酵培养：按每瓶一环活化斜面菌种的量接种于液态摇瓶发酵培养基，置于200r/ min 恒 温摇床，28℃恒温振荡培养96小时。 生物反应器及其运行条件：反应器的有效容积为30L，配备有两层搅拌桨，T/D=0.5，D=0.3m； 发酵液的溶氧浓度 DO 值采用原电池型溶氧电极插于两层搅拌桨之间自动检测；采用 1%的 H2SO4 溶液和1%的NaOH溶液自动控制调节发酵液的pH值；发酵温度26℃，转速800r/min， 通气比为 1:1vvm，发酵周期90小时。
2.2.4.2 菌体形态的观察
取不同发酵阶段的黄原胶发酵液，稀释、涂片、染色，油镜下观察黄原胶在不同发酵时期 的基本形态。
2.2.4.3 发酵培养基的优化
根据野油菜黄单胞杆菌的培养特性，结合野油菜黄单胞杆菌的生物学特性，利用均匀试验 方法[13]优化其培养基配方。根据一定的基础研究结果，选用均匀试验设计表 U10*（103），优化 试验的因素水平表见表2.1。
2.2.4.4 淀粉液化程度对黄原胶产率的影响
在黄原胶的工业化生产过程中，为了降低搅拌难度，使灭菌彻底，通常在灭菌前需要向培养 基中加入一定量的α-淀粉酶，使培养基中的淀粉液化，但淀粉的液化程度（α-淀粉酶的加入量 和液化时间）对黄原胶的产率有着明显的影响。本文采用单因素法分别考察了 α-淀粉酶 （20000U/ml）的用量和液化时间对发酵液中黄原胶浓度的影响。
2.2.4.5 发酵条件的优化
将上述优化出的培养基配方放大到30L的机械搅拌式生物反应器中进行深层培养，在原有发 酵条件的基础上，采用三因素三水平的正交试验[14]对影响黄原胶发酵生产最为显著的三个因素： 温度、通气量和搅拌转速进行了优化。根据正交试验设计的基本原理，选用L934表中的1、2、3 三列，设计了如表2.2所示的3因素3水平的正交试验表。
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 菌体形态的变化
图2.1 中a、b、c、d分别是摇瓶培养至第20、26、32、38小时XG-101黄单胞杆菌的菌体 油镜照片，从图中可以看出这几个阶段菌体形态变化十分明显。第20小时，菌体个体较小，以 短杆状存在，形态比较丰满。第26小时，菌体长轴不断加长，由短杆状变为长杆状。这一阶段 菌体生长迅速，菌体显著加长表明细胞壁和细胞膜的扩展速度超过DNA的复制速度，这对黄原 胶的合成非常有利，因为黄原胶合成的酶系和磷脂载体都存在于细胞膜上[7]。此外，大部分菌体 的中间处有分段的迹象，此时菌体已经开始进行分裂繁殖。第32小时，菌体周围出现透明圈， 开始分泌黄原胶。最先分泌的黄原胶都是源于菌体的端部，然后扩展到菌体四周，这可能是菌 体端部是新生壁，比较薄的缘故。此时菌体主要以杆状存在，也有些部分菌体以链状存在，以链状存在的菌体可能是由于菌体产生的少量黄原胶而粘连在一起的。第38小时，菌体产胶明显 增加，有些菌体已经完全被透明状胶体包围。由于菌体生长的不同步性，此时菌体形态多样， 有些菌体尚未明显产胶，为实心杆状；有些菌体处于二分裂期，菌体形状为中间细两头粗，总 体看过去仍为实体杆状；有些菌体被黄原胶包围，胶体中间含有一粒或两粒已经完全分开的实 心物质，此实心物质即为野油菜黄单胞杆菌。
黄原胶的发酵动力学为菌株生长与产物合成非偶联类型，发酵过程由菌体的生长代谢阶段和 产物的合成阶段两个阶段组成，这一结论由黄原胶发酵过程中菌体的形态变化可以得到进一步 的验证。黄单胞杆菌在分泌产生黄原胶之前菌体长度的显著增加可以作为黄原胶产生的前兆， 这在工业生产上具有一定指导作用.
2.3.2 发酵培养基的优化
根据表2.1三因素十水平均匀实验因素水平表配制培养基，分别进行摇瓶培养，对发酵液中 黄原胶浓度进行测定，其实验结果见表2.3。
对上述结果按照均匀实验设计方法进行数据处理，有下列回归方程：
y = a0 a1x1 a2x2 a3x3 ①
式中x1、x2、x3分别表示培养基配方中淀粉、豆粉、碳酸钙的浓度。
对上述方程进行计算机回归，可以得到下列回归方程：
y = 0.54 0.54x1 0.12x2 0.19x3 ②
其中标准差s =0.11，F =110，样本数 N =10，自变量M =3，置信水平ａ= 0.05，查表得到 F.05（3，6）= 4.7571。
因为F＞F.05（3，6），这表明 y的变化主要是由于x1、x2、x3的变化引起的，回归方程②可 信。对回归方程进行分析，在上述各项参数优化的范围内，培养基配方中淀粉和豆粉含量越高 发酵液中黄原胶浓度就越高，因此我们取其优化范围内的最大值。碳酸钙作为培养基中的无机 盐对发酵液中黄原胶浓度影响较小，但却是不可缺少的，本着节省原材料而又不影响发酵液中 黄原胶浓度的原则，我们取其优化范围内的中间值，由此得到黄原胶发酵培养基的最佳配方见 表2.4：
优化号的计算值区间可用下式估算y = y* ± µａ ×S
式中：y*为优化号按照②式的计算值，y* = 2.81
S为标准差S = 0.12 ③ µａ 为置信水平为ａ时的标准正态变量，查表得（µａ 0.05）= 1.96 则y = 2.81 ± 0.22
即y值得范围应为 2.59～3.03g/100mL。
对上述优化出的培养基进行摇瓶培养验证，其结果见表2.5：
上述结果表明，按优化条件进行摇瓶培养，发酵液中黄原胶浓度均在预测范围内，且两次 实验发酵液中黄原胶的平均浓度为2.88 g/100mL，也在预测范围内，其结果高于表2.3中的每次 实验结果，由此可认为优化出的上述摇瓶培养基配方是可靠的。 在黄原胶生产中，发酵培养基是决定生产成功与否的重要因素之一，它不仅对黄原胶的产量影响很大，而且对产物的质量和性能也有一定的作用。此外还影响到工业生产的成本，因此选 择适合工业生产的发酵培养基是非常重要的[15]。
2.3.3 淀粉液化程度对黄原胶发酵的影响
2.3.3.1 α-淀粉酶用量对黄原胶发酵的影响
30L 机械搅拌式生物反应器黄原胶发酵的放大实验中，灭菌之前需要向培养基中加入一定量 的α-淀粉酶，本文采用单因素法在三角瓶水平上对α-淀粉酶的用量进行了初步研究，分别以正 常淀粉酶用量（100U/g淀粉）的0倍、1/3200、1/1600、1/800、1/400、1/200、1/100、1/50的量 向发酵培养基中加入α-淀粉酶，60℃时液化2min。发酵结束后，用酒精直接沉淀法提取黄原胶， 计算发酵液中黄原胶浓度，分别以 α-淀粉酶用量和发酵液中黄原胶浓度为纵横坐标绘制曲线， 得图2.2。
由图 2.2 知发酵液中黄原胶浓度与 α-淀粉酶用量有着明显的关系，当 α-淀粉酶用量为 0.25U/g 淀粉时，发酵液中黄原胶浓度最大。通常在以淀粉质原料为碳源的微生物发酵中，灭菌 前需要向培养基中加入适量的淀粉酶，使淀粉液化，其目的主要是降低培养基的粘度，促进传 热，使灭菌更加彻底，其次淀粉液化可以产生一定量的葡萄糖，为发酵初期菌体生长提供所需 的葡萄糖。葡萄糖碳源不仅是合成黄原胶的基质，也是菌体增殖的物质基础，黄原胶的产量与 碳源种类和底物浓度有着直接的关系。当α-淀粉酶用量不足 0.25U/g 淀粉时，淀粉液化不能产 生足够的葡萄糖以供菌体生长使用，影响了后期黄原胶的合成，致使发酵液中黄原胶浓度降低。α-淀粉酶用量超过0.25U/g淀粉时，淀粉液化比较充分，产生大量的葡萄糖，培养基中葡萄糖浓 度过高使渗透压增大，抑制了菌体生长，导致黄原胶产率降低。
2.3.3.2 淀粉的液化时间对黄原胶发酵的影响
发酵培养基中按淀粉酶最佳用量添加 α-淀粉酶，60℃处液化，液化时间分别为 0 分钟、2 分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟。液化结束后，迅速使α-淀粉酶失活。接种发酵后用酒 精直接沉淀法提取黄原胶，计算发酵液中黄原胶浓度，分别以液化时间和发酵液中黄原胶浓度 为纵横坐标绘制曲线，得图2.3。
由图中变化曲线可知，淀粉的液化时间在2分钟时，发酵液中黄原胶浓度最大，当液化时 间不足2分钟或超过2分钟时，发酵液中黄原胶的浓度均低于2分钟时的黄原胶浓度。淀粉作 为迟效碳源，在α-淀粉酶的作用下液化生成一部分葡萄糖，淀粉液化程度与α-淀粉酶用量和液 化时间有着直接关系，α-淀粉酶用量一定的情况下，液化时间越长，培养基中的葡萄糖就越多， 越不利于黄源胶的发酵。其原因可能是，葡萄糖作为速效碳源可以直接被菌体生长所利用，当 培养基中葡萄糖浓度过高时产生降解阻遏效应。葡萄糖分解代谢的降解物能够抑制腺苷酸环化 酶活性并活化磷酸二酯酶，降低cAMP的浓度，使许多分解代谢酶的基因不能转录，而黄原胶 作为含有对降解物敏感的微生物受到降解物的阻遏[16]，影响了产胶。
通常在工业生产中，以淀粉质原料为碳源的培养基，在灭菌之前需要加入一定量的α-淀粉 酶使淀粉液化，淀粉液化的同时会产生一定量的葡萄糖，而发酵初期培养基中的葡萄糖浓度对发酵液中黄原胶的浓度有着明显的影响，通过控制淀粉的液化程度可以控制葡萄糖的浓度。淀 粉的液化程度可以通过α-淀粉酶的用量和液化时间来进行控制，合理的淀粉酶用量及液化时间 有利于提高黄原胶的产率，因此在黄原胶的工业生产中对于淀粉液化程度的研究也是十分有意 义的。
2.3.4 发酵条件的优化
在上述优化培养基配方、最佳α-淀粉酶用量及液化时间的基础上将黄原胶发酵放大到30L的 机械搅拌式生物反应器中进行深层培养。采用正交实验法，对影响黄原胶发酵生产的最为显著 的三个因素：温度（℃）、通气量（L·L-1）和搅拌转速（r/min），进行优化研究。优化结果见表 2.6。
对上述结果按照正交实验设计方法进行数据处理，有下列回归方程：
y = a0 a1x1 a2x2 a3x3 ⑤
式中x1、x2、x3分别表示发酵条件中的温度、通风比、转速。
对上述方程进行计算机回归，可以得到下列回归方程：
y = 5.2639 - 0.1x1 0.0588x2 0.0004x3 ⑥
其中标准差s = 0.1，F = 8.64，样本数 N = 9，自变量M =3，置信水平ａ= 0.05，查表得到 F.05（3，5）= 5.41。
因为F＞F.05（3，5），这表明y的变化主要是由于x1、x2、x3的变化引起的，回归方程⑥ 可信。对回归方程进行分析，参数温度的系数为负值，对黄原胶发酵的影响是相反的，即在给定范围内温度越小越有利于黄原胶的发酵，因此我们取其最小值；通风比、转速的系数均为正 值，对黄原胶发酵的影响是积极的，即发酵过程中通风比和转速越高越有利于黄原胶的发酵， 但考虑到生物反应器的实际承受能力我们取其中间值。因此在本实验条件范围内，黄原胶的最 佳发酵条件见表2.7：
在最佳培养基配方、α-淀粉酶用量及液化时间的基础上对上述发酵条件进行验证，两次验 证结果的黄原胶浓度分别为3.03g/100ml，3.17 g/100ml。验证结果远高于发酵条件优化之前的黄 原胶浓度（2.7 g/100ml）。
2.4 小结
本章探讨了黄原胶发酵过程中菌体形态的变化、发酵培养基配方、淀粉液化程度及发酵条件 对黄原胶生产的影响。通过对黄原胶发酵过程中不同阶段菌体形态的观察，揭发了黄原胶的发 酵本质，为黄原胶的生产提供理论依据；在原有发酵培养基配方研究的基础上，应用均匀实验 法对培养基中的主要成分淀粉、豆饼粉和碳酸钙进行优化，得出了黄原胶发酵生产的最佳培养 基配方为：4g/100ml淀粉、0.6g/100ml豆饼粉、0.2g/100ml碳酸钙；在黄原胶的放大发酵过程中， 对淀粉的液化程度进行了初步研究，确定了影响淀粉液化程度的α-淀粉酶的加入量及液化时间， 研究结果表明α-淀粉酶的最佳用量和液化时间分别为：酶活力为20000U/ml的情况下，每克淀粉 的用量为0.25U，液化2分钟；最后结合上述实验结果，在30L机械搅拌式生物反应器水平上对黄 原胶发酵的条件进行了优化，得最佳发酵条件为：温度26℃、通风比1：1 vvm、搅拌转速800r/min。
实验结果表明，在此最佳实验条件下采用酒精直接沉淀法时，发酵液中黄原胶的浓度均在 3.0以上。据报道由美国专利4, 119, 546所制备的发酵液，黄原胶浓度为3.36 g/100ml；山东大 学江伯英等人[17]使用黄单胞菌S-152所得发酵液黄原胶浓度最高为2.78 g/100ml；中科院微生物所 王修垣等人以4%蔗糖为底物、由黄单胞杆菌L4生产的发酵液中黄原胶浓度[18]为2.82 g/100ml；本 实验发酵液中黄原胶浓度3.01%，高于或接近上述文献值。
图文来源 | XG-101黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究
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