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黄单胞菌发酵生产黄原胶的研究（四）

发布时间：2025-03-21

四、反应器内部结构对黄原胶发酵的影响

4.1 前言

黄原胶在发酵过程中其生物合成非常复杂，且发酵液具有很高的粘度，是典型的假塑性流 体[24]。特别是发酵中后期，随着发酵液粘度的增加，发酵过程中氧的传递、气液混合以及热量 的传递等都受到了显著的影响，这一问题是目前提高黄原胶发酵生产水平的主要制约因素，而 且对黄原胶的质量诸如：粘度、分子量分布、流变特性等也存在不良的影响[25～26]。改变目前国 内黄原胶生产普遍使用的六直叶涡轮搅拌系统，延长气体在罐内的停留时间，提高混合效率， 开发适合黄原胶高粘性物系发酵的新型搅拌系统，对于解决黄原胶发酵过程中存在的上述问题， 有着重要的现实意义。

本实验室在黄原胶水溶液的冷模实验状态下，分别对底层桨采用六直叶圆盘涡轮、六凹叶 圆盘涡轮、六叶布鲁马金，上层桨采用六斜叶圆盘涡轮（上推式和下压式）、双折叶圆盘涡轮（上 推式和下压式）等几种桨型组合进行了系统的研究，选出了一组消耗功率较小，而气含率和Kla 值较高的桨型组合——上层桨为下压式双折叶圆盘涡轮，下层桨为六叶布鲁马金，将该桨型组 合应用于机械搅拌式生物反应器黄原胶的发酵，针对发酵过程中黄原胶的浓度、粘度、淀粉含 量等参数的变化与传统的六直叶圆盘涡轮进行了对比研究，并在此新型搅拌桨状态下初步探讨 了挡板、挡板宽度对黄原胶发酵的影响，以期得到一组适合黄原胶等高粘性物系发酵的新型搅 拌器，进而开发适合于黄原胶等高粘性物系发酵的新型机械搅拌式生物反应器。

4.2 实验材料与方法

4.2.1 菌种

菌种 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）XG-101，本实验室选育的优良菌种。

4.2.2 实验试剂及仪器

甲醛（分析纯）                  烟台三和化学试剂有限公司

浓盐酸（分析纯）                烟台三和化学试剂有限公司

浓硫酸（分析纯）                烟台三和化学试剂有限公司

硫酸铜（分析纯）                烟台三和化学试剂有限公司

氢氧化钠（分析纯）              烟台三和化学试剂有限公司

 三乙醇胺（分析纯）             烟台三和化学试剂有限公司

 碳酸氢钠（分析纯）             烟台三和化学试剂有限公司

酒石酸钾纳（分析纯）            烟台三和化学试剂有限公司

 葡萄糖（分析纯）                中国医药集团上海化学试剂公司

碳酸钠（分析纯）                 上海虹光化工厂

次甲基蓝（分析纯）               天津市科密欧化学试剂开发中心

乳酸脱氢酶（分析纯，≥30U/mg ）  上海三杰生物技术有限公司

还原性辅酶Ⅰ（分析纯, ≥99%）      上海三杰生物技术有限公司

NDJ—79型旋转粘度计             同济大学机械厂

全自动生物反应器MSJ-u3          B.E.MARUBISHICO.LTD.，JAPAN；

752 型紫外可见分光光度计         上海菁华科技仪器有限公司

HH-S11-N15 型电热恒温水浴锅     龙口市先科仪器公司

ZD-2 型自动电位滴定仪            上海精密科学仪器有限公司

4.2.3 培养基

菌种斜面培养基（g/L）：淀粉 5.0，牛肉膏 3.0，NaCl5.0，蛋白胨 10.0，琼脂 15.0～20.0，pH 值7.4。

菌种扩大培养基（g/L）：（NH4）2SO4 1g/L，MgSO4 0.12g/L，CaCO3 2g/L，酵母浸粉2.4g/L， 淀粉10.6g/L，葡萄糖2.1g/L，初始pH7.4。

发酵培养基（g/L）：淀粉40g/L，豆粉6g/L，CaCO3 2g/L，初始pH7.4。

4.2.4 生物反应器及其运行条件

生物反应器及其运行条件：反应器的有效容积为30L，配备有两层搅拌桨，T/D=0.5，D=0.3m； 发酵液的溶氧浓度 DO 值采用原电池型溶氧电极插于两层搅拌桨之间自动检测；采用 1%的 H2SO4 溶液和1%的NaOH溶液自动控制调节发酵液的pH值；发酵温度26℃，转速800r/min， 通气比为1:1vvm，发酵周期90小时。

4.2.5 分析方法及原理

4.2.5.1 发酵液粘度的测定

用NDJ—1型旋转粘度计，室温，30rpm 下测定。

4.2.5.2 黄原胶浓度的测定

工业乙醇（95%）沉淀出胶体，洗涤后70℃真空干燥后称重。

4.2.5.3 发酵液中菌体浓度的测定

分光光度计650nm处测定OD值。

4.2.5.4 还原糖、淀粉浓度的测定     

还原糖及淀粉浓度测定的原理[27]：

淀粉经酸或酶水解生成葡萄糖：

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所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。 斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时 甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：

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所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解：67d398a28cd57.png

酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生 成一价的氧化亚铜沉淀：

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反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜被还原后， 过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点。

具体测定方法：

a.斐林试剂的标定 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入20毫升水， 并从滴定管中预先加入约24毫升0.2%标准葡萄糖溶液，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸 2分钟。加2滴1%次甲基蓝溶液，以4～5秒钟1滴的速度继续用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至 蓝色消失。此滴定操作需在1分钟内完成，其消耗0.2%标准葡萄糖溶液应该控制在1毫升以内。 总耗糖量为V0毫升。

b.试样水解 称取黄原胶发酵液5g，置入250毫升三角瓶中，加入100毫升1:4盐酸溶液，瓶 口按上回流冷凝器或长玻璃管，于沸水浴中回流水解半小时。取出，迅速冷却，并用 20%氢氧 化钠溶液中和至中性或微酸性。脱脂棉过滤，滤液用500毫升容量瓶接收。用水充分洗涤残渣， 然后用水定容至刻度，摇匀，为供糖试液。

c.定糖：

预备试验 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，准确加入20毫升水 解糖液，摇匀，于电炉上加热至沸，加2滴1%次甲基蓝溶液，用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至 蓝色消失。耗糖量为V1毫升。

正式试验 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，准确加入20毫升水 解糖液，补加约（V0- V1）毫升水，并从滴定管中预先加入约（V1-1）毫升 0.2%标准葡萄糖溶液， 摇匀，于电炉砂锅内加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1%次甲基蓝溶液，以4～5秒钟1 滴的速度继续用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失。其消耗0.2%标准葡萄糖溶液应该控制在 1毫升以内。总耗糖量为V毫升。

d.计算

淀粉（%）=（V0-V）*C*500/20*1/W*0.9*100%

式中 V0——斐林试剂标定值（毫升）

 V——斐林试剂测定值（毫升）

C——标准葡萄糖溶液浓度（克/毫升）

W——试样重量（克）

500/20——20 为测定时所取水解糖液体积，500为水解糖液总体积（毫升）

4.2.5.6 黄原胶中丙酮酸含量的测定

Duckworth 和Yaphe 的酶法测定丙酮酸含量的原理[28] 黄原胶经酸水解可释放分子组成中的丙酮酸，丙酮酸可进行如下酶促反应：

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NADH在340nm处有最大吸收峰，而NAD 没有吸收峰。在340nm处测定吸收值的变化即可定量求出丙酮酸含量

精确称取黄原胶5mg，置于2ml 1mol/L的HCl中，100℃水解3h后，加入2ml 2mol/L Na2CO3 溶液中和，用水稀释至10ml，取 2ml稀释液至1cm的石英杯中，加入1ml 1mol/L三乙醇胺缓冲 液，50µl还原型辅酶Ⅰ(10mg/ml，溶剂为 1% NaHCO2)，340nm波长下测吸光度(A1)，再加 6µ乳酸脱氢酶(272U/mg)，5min后测吸光度，此后每隔1min测一次，直至数值稳定，此吸光度值 为A2。以下列公式计算丙酮酸含量：

丙酮酸(%) =5×88×100 (A1- A2) ×3.05样品质量/Sw/6.22/1000

其中：5 为稀释倍数，88 为丙酮酸的分子量, 3.05 为溶液体积, Sw为黄原胶样品重量（mg）, 6.22 为还原型辅酶I(NADH)的毫摩尔吸光系数。

4.2.6 反应器内部结构

4.2.6.1 搅拌器的型式

新型组合搅拌器和传统搅拌器的结构及其流场描述如图4.1和4.2所示：

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4.2.6.2 挡板型式

采用全深型挡板，窄挡板宽度为20mm，宽挡板宽度为34mm。

4.3 实验结果及讨论

4.3.1 不同桨型组合对发酵的影响

4.3.1.1 不同搅拌桨对发酵液黄原胶浓度的影响

图4.3 可见，新桨（以下称改进桨）体系下黄原胶稳定产胶期提前，整个发酵过程中黄原胶 浓度始终高于原桨（以下称传统桨）体系。改进桨的上层采用下压式双折叶圆盘涡轮、下层采 用六叶布鲁马金，两种桨都能在产生径向流的同时又能产生轴向流，尤其是布鲁马金属于剪切 循环兼顾型叶轮，适用于既需要一定剪切、又需要高循环的场合，而下压式双折叶圆盘涡轮在 产生很强剪切流的同时又能产生一定的轴向流，强化了混合效果，较好地满足了黄原胶发酵液 对较大流动循环量的需求，改善了反应器内部的传质混合效果。

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黄原胶属次生代谢产物，发酵动力学为菌株生长与产物合成非偶联类型，与抗生素和微生 物毒素等物质合成代谢类似，代谢产物的合成是在菌体浓度接近或达到最高后才开始的[29]。改 进桨体系下良好的传质混合效果缩短了菌体的增殖期，发酵液中黄原胶浓度的稳定增长期提前， 明显早于传统桨体系。黄原胶发酵过程初期表现为低粘度的牛顿体系，随着产物的形成和积累， 发酵液粘度渐增，在后期呈现为高粘度的假塑性非牛顿体系，限制了氧的传递和其他营养物质 的交换，影响黄原胶产量的进一步提高。78 小时后发酵液中黄原胶浓度继续增加，改进桨体系 下黄原胶浓度的增长幅度高于传统桨。改进桨组合较好的气液分散效果，较高的气含率，较大 的传质系数，气体在罐内较长的停留时间，在一定程度上克服了发酵后期存在的上述问题。

4.3.1.2 不同搅拌桨对发酵液粘度的影响

图4.4 可见，改进桨体系下发酵中后期黄原胶发酵液的粘度高于传统桨体系发酵液的粘度。通常黄原胶发酵液的粘度与黄原胶的浓度、平均分子量之间有着正相关的关系。对照图4.3可以 看出，改进桨体系下发酵液中黄原胶浓度的增加与其粘度的增加均高于传统桨体系，根据黄原 胶发酵液粘度与黄原胶浓度、平均分子量间的正相关关系，只有在平均分子量没有降低的条件 下，黄原胶发酵液的粘度才会随其浓度的增加而增加，而改进桨体系下发酵液中黄原胶浓度与 其粘度的同时增加也正说明了在此桨体系下并没有使黄原胶的平均分子量降低。

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4.3.1.3 搅拌对发酵液中碳源浓度的影响

图4.5可见，改进桨体系下最终发酵液中淀粉浓度低于传统桨体系，而葡萄糖浓度基本相同。 碳源不仅是合成黄原胶的基质，也是菌体增殖的物质基础，黄原胶的产量与碳源种类和底物浓 度有着直接的关系。通常发酵液中淀粉浓度、葡萄糖浓度、产物的浓度之间存在着一种动态平 衡。以淀粉质为原料的黄原胶发酵初始，由于淀粉的液化，培养基中存在少量的葡萄糖，此后 随着菌体的迅速繁殖，其分泌的胞外淀粉酶活力也随着增加，淀粉被逐渐水解为葡萄糖，发酵 液中淀粉浓度随之降低，葡萄糖浓度增加。

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改进桨体系下前36小时淀粉浓度下降迅速，相对应的葡萄糖浓度在此段时间内出现了最大 值，而传统桨体系下则无此明显下降趋势，淀粉浓度始终处于改进桨之上，葡萄糖浓度亦低于 改进桨体系。36小时后菌体增殖缓慢，甚至停止增殖，菌体由生长型转为产物积累型，淀粉继 续被胞外淀粉酶水解成葡萄糖，此时大量的葡萄糖被用于黄原胶的生物合成，至到发酵结束。

在任何微生物发酵过程中，根据生物反应动力学原理，当发酵液中的底物下降到一定浓度 时，菌体代谢速率非常缓慢，在工业生产中可以结束发酵。本研究中黄原胶发酵结束时改进桨 体系与传统桨体系发酵液中的残糖含量基本相同，均下降到0.5%以下。但是，对照图4.3 可以 看出，改进桨体系下发酵液中的黄原胶浓度明显的高于传统桨体系，那么合成这部分黄原胶的 底物葡萄糖来自于哪里？对照图4.5可以看出，改进桨体系下发酵液中残留淀粉浓度始终低于传 统桨体系，直到发酵结束。这是由于改进桨良好的混合传质效果，强化了胞外淀粉酶与底物淀 粉的充分接触，有利于淀粉的快速水解，也就是说，改进桨体系条件下多合成的这部分黄原胶 所需要的葡萄糖正是来自于良好的淀粉水解。培养基中的淀粉最大程度的水解为合成黄原胶所 需要的葡萄糖，既有利于黄原胶产率的提高，又有利于黄原胶的提取。

4.3.1.4 不同桨型组合对于发酵液混合的影响

在黄原胶的生物发酵过程中，由于黄原胶具有高粘度的特性，不但导致了其发酵中后期粘 度过大，给发酵过程中氧的传递、气液混合以及热量的传递等带来了很大的困难[30]，而且在靠 近反应器内壁处还存在一个基本上静止不动的发酵液区域，在此区域内，氧和其他营养物质的 传递、交换更为困难，导致了细胞活力的下降甚至细胞死亡。研究表明，发酵结束后，无论是 在改进桨体系下还是在传统桨体系下，运动区与静止区的发酵液中黄原胶浓度、粘度、残糖浓 度等各项参数都有着明显的差异，见表4.1。

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表1数据表明，无论是在改进桨体系下还是在传统桨体系下，发酵中后期均有发酵液静止区 出现，而且其体积均随发酵的进行而增大；运动区发酵液中黄原胶浓度、粘度、丙酮酸的含量 始终高于静止区，而葡萄糖含量和淀粉含量则低于静止区，运动区黄原胶的综合指标明显高于静止区。

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搅拌操作时，用搅拌器对低粘度互溶液造成湍流并不困难，但粘度达到较高水平后，由于 粘滞力的影响，就只能出现层流状态。尤其困难的是，这种层流也只能出现在搅拌器附近，离桨叶稍远些地方的高粘度液体仍是静止的。这样就很难造成液体在搅拌设备内的循环流动，即 在设备内会有死区存在，对混合、分散、传热、反应等各种搅拌过程十分不利。所以高粘度液 体搅拌的首要问题就是要解决流体流动与循环的问题，设法使搅拌器推动更大范围的液体[31]。 如图4.7所示，改进桨体系由于较大的轴向循环量推动了更大范围的液体，促进了反应器内部的 总体混合，其静止区明显减少。评价任何生物反应过程，其最终的产率或者底物—产物转化率 都是一个重要指标，甚至是决定性指标。如上所述改进桨能提高黄原胶发酵液的浓度，必然增 加了黄原胶的糖胶转化率，同时又由于其静止区的体积减少，也带来了黄原胶产率的增加，并 且提高了高质量黄原胶的含量。因此可以说这种桨型组合应用于黄原胶等高粘性物系的发酵， 在一定程度上能够克服发酵后期粘度过高而带来的氧和其他营养物质的传递、交换困难的难题， 适合于高粘性物系的发酵。

4.3.2 档板尺寸对发酵过程的影响

4.3.2.1 档板对菌体生长的影响

黄原胶发酵过程中发酵液的吸光度光度值随时间不断变化，发酵液吸光度的变化可以看作 是其中菌体量的变化，故吸光度随时间的变化曲线可以看作是菌体的生长曲线，体现发酵过程 中菌体的生长情况[32]。图 4.8可见，原挡板条件下，菌体生长曲线随发酵时间不断上升，没有明 显的对数生长期和稳定期；无挡板和窄挡板条件下，菌体生长曲线符合正态分布，与微生物的 典型生长曲线完全相符。挡板的设置有利于增加流体的湍动效果，同时也对流体产生了相当大 的剪切力。原挡板条件下发酵液受到的剪切力相对于无挡板条件和窄挡板条件要大，而黄单胞杆菌作为一种较为脆弱的菌体，生长初期对环境的剪切作用非常敏感，因此原挡板条件下菌体 的生长情况明显差于无挡板条件和窄挡板条件。

黄原胶属次生代谢产物，其发酵动力学为菌株生长与产物合成非偶联类型， 代谢产物的合 成是在菌体浓度接近或达到最高后才开始的[33]。为获得高产，培养条件要求短的对数生长期和 长的稳定期，或降低对数生长期的生长率，已提早形成次级代谢产物，原挡板条件不利于黄原 胶产物的获得。

4.3.2.2 档板对发酵的影响

对发酵过程中黄原胶的浓度、粘度、以及发酵液中葡萄糖和淀粉含量进行了测定，对这些 参数与它们的发酵时间作图，分析挡板对发酵的影响，见图4.9、4.10、4.11、4.12。

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上述各项数据表明：对于黄原胶发酵，在改进桨体系下，窄挡板和无挡板条件下发酵液中 黄原胶浓度和粘度明显高于原挡板条件；发酵结束时窄挡板和无挡板条件下葡萄糖含量和淀粉 含量亦明显低于原挡板条件。对于窄挡板和无挡板这两种状态，无挡板条件下发酵液静止区的 体积小于窄挡板条件，并且发酵液静止区体积的大小与挡板宽度之间还存在着正相关的关系， 挡板越宽，其静止区体积越大。

通常，对于低粘度物系，为了消除搅拌容器内液体的打旋现象，使被搅物料能够上下轴向 流动，需要在搅拌容器内加入若干块挡板。安装在筒体内壁的挡板可把回转的切向流动改变为 径向和轴向流，较大地增加了流体的剪切强度，增大湍动程度，改善主体循环，促进全釜的均 匀混合；同时还能降低搅拌载荷的波动，使功率消耗保持稳定。但是，许多研究表明，当物料 的粘度增加时，挡板的宽度可相应的减少，当粘度达到10Pa·S时，可以不再按装挡板[34]。对于 黄原胶这种高粘性物系，在发酵初期，由于没有黄原胶产生或产生的量很少，发酵液的粘度较低，搅拌器很容易在全罐内形成湍流，从而达到全罐的混合。但是随着发酵的进行，黄原胶浓 度不断增大，发酵液变得越来越粘稠，搅拌器的工作状态逐渐由湍流域转变为过渡流域或层流 域，这时仅叶轮周围的液体随叶轮旋转。由于粘滞力的影响，随着离搅拌器距离的增加，流体 速度下降得越来越明显，此时罐壁处的发酵液流速更小。当在罐壁处加装挡板后，以较低速度 运动的发酵液迅速在挡板前后形成停滞区域，此时挡板的存在严重影响了全罐的混合，这对黄 原胶的发酵生产是十分不利的。因此，缩小挡板宽度或将挡板拆除后，相对于原有挡板条件下 发酵液更容易形成规整的循环流，有利于整个发酵液的均匀混合，适合于黄原胶这种高粘性物系的发酵。这一研究结果，与李卫旗，姚恕[35]研究的在传统平叶搅拌器发酵设备中适当减小挡 板数目或不设挡板更有利于黄原胶高粘性物系发酵的研究结果一致。

4.4 小结

本章在最佳发酵工艺条件下，针对新的桨型组合对发酵过程的影响、挡板对发酵过程的影 响进行了研究。研究结果表明，新的桨型组合在保持好的径向气体分散能力的同时，加强了轴 向循环混合的能力，明显改善了反应器内部混合状态，具有以下明显的优点：

（1）新型桨组合较大的流动循环量、优良的传质混合效果缩短了黄原胶进入稳定产胶期所需的 时间。

（2）新型桨组合提高了整个发酵过程黄原胶的浓度，提高了发酵液的粘度，

（3）改进桨组合较高的传质系数、较好的宏观稳定流型提高了碳源的利用率，减少了最终发酵 液中淀粉的残留量，降低了后提取工艺的难度与能源消耗。

（4）新型桨组合较强的搅拌混合效果降低了静止区的厚度，促进了氧的传递，增强了营养物质 的交换，提高了发酵液中黄原胶的浓度和质量。

对于黄原胶发酵体系，采用窄挡板或无挡板的釜内结构形式有利于物料混合，提高发酵过程效率。

五、结论与展望

5.1 结论

（1）黄原胶发酵过程由菌体的生长代谢阶段和产物的合成阶段组成；XG-101 黄单胞杆菌发酵 生产黄原胶的最佳培养基配方：淀粉 0.4g/L，豆粉 0.06g/L，碳酸钙 0.02g/L；α-淀粉酶活力 20000U/ml 时，用量0.25U/淀粉，液化2分钟时发酵液中黄原胶的浓度最高；最佳发酵条件：温 度26℃、通风比为1：1 vvm、搅拌转速800r/min。

（2）下压式双折叶圆盘涡轮与六叶布鲁金桨组合在具有较高气含率及容积氧传质系数的同时功 耗较低，具有较好的搅拌混合效果，有利于解决黄原胶发酵后期粘度过高所引起的传质混合困 难等问题。

（3）采用下压式双折叶圆盘涡轮与六叶布鲁金桨组合，缩小挡板尺寸或拆除挡板，可以在保持 好的径向气体分散能力的同时，加强了轴向循环混合的能力，明显改善了反应器内部混合状态， 缩短了黄原胶进入稳定产胶期所需的时间、提高了发酵液中黄原胶的浓度和质量以及发酵液的 粘度、减少了最终发酵液中淀粉的残留量，降低了后提取工艺的难度与能源消耗。

5.2 展望

高粘度、低溶氧浓度始终是困扰黄原胶生产的一个问题, 间歇法发酵设备主要是带搅拌的 反应器，它是目前唯一工业化的设备。工业生产黄原胶大都在机械搅拌发酵反应器内进行，由 于发酵液的高粘度和强假塑性而是发酵罐内出现大量的死区，造成黄原胶发酵周期长，产胶浓 度低、能耗高，因此开发新型的适用于黄原胶发酵过程的生物反应器就显得特别重要。所谓反 应器的选择也就是搅拌桨形式的选择，本实验室将在上述实验结果的基础上继续研究新的桨型、 改变桨型组合层数、并考察反应器内部构件对黄原胶发酵的影响，开发适合于黄原胶等高粘性 物系发酵的新型生物反应器，将其应用于黄原胶热膜发酵进行检验。


图文来源 | XG-101黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究

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黄单胞菌发酵生产黄原胶的研究（四）

发布时间：2025-03-21

四、反应器内部结构对黄原胶发酵的影响

4.1 前言

黄原胶在发酵过程中其生物合成非常复杂，且发酵液具有很高的粘度，是典型的假塑性流 体[24]。特别是发酵中后期，随着发酵液粘度的增加，发酵过程中氧的传递、气液混合以及热量 的传递等都受到了显著的影响，这一问题是目前提高黄原胶发酵生产水平的主要制约因素，而 且对黄原胶的质量诸如：粘度、分子量分布、流变特性等也存在不良的影响[25～26]。改变目前国 内黄原胶生产普遍使用的六直叶涡轮搅拌系统，延长气体在罐内的停留时间，提高混合效率， 开发适合黄原胶高粘性物系发酵的新型搅拌系统，对于解决黄原胶发酵过程中存在的上述问题， 有着重要的现实意义。

本实验室在黄原胶水溶液的冷模实验状态下，分别对底层桨采用六直叶圆盘涡轮、六凹叶 圆盘涡轮、六叶布鲁马金，上层桨采用六斜叶圆盘涡轮（上推式和下压式）、双折叶圆盘涡轮（上 推式和下压式）等几种桨型组合进行了系统的研究，选出了一组消耗功率较小，而气含率和Kla 值较高的桨型组合——上层桨为下压式双折叶圆盘涡轮，下层桨为六叶布鲁马金，将该桨型组 合应用于机械搅拌式生物反应器黄原胶的发酵，针对发酵过程中黄原胶的浓度、粘度、淀粉含 量等参数的变化与传统的六直叶圆盘涡轮进行了对比研究，并在此新型搅拌桨状态下初步探讨 了挡板、挡板宽度对黄原胶发酵的影响，以期得到一组适合黄原胶等高粘性物系发酵的新型搅 拌器，进而开发适合于黄原胶等高粘性物系发酵的新型机械搅拌式生物反应器。

4.2 实验材料与方法

4.2.1 菌种

菌种 野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）XG-101，本实验室选育的优良菌种。

4.2.2 实验试剂及仪器

甲醛（分析纯）                  烟台三和化学试剂有限公司

浓盐酸（分析纯）                烟台三和化学试剂有限公司

浓硫酸（分析纯）                烟台三和化学试剂有限公司

硫酸铜（分析纯）                烟台三和化学试剂有限公司

氢氧化钠（分析纯）              烟台三和化学试剂有限公司

 三乙醇胺（分析纯）             烟台三和化学试剂有限公司

 碳酸氢钠（分析纯）             烟台三和化学试剂有限公司

酒石酸钾纳（分析纯）            烟台三和化学试剂有限公司

 葡萄糖（分析纯）                中国医药集团上海化学试剂公司

碳酸钠（分析纯）                 上海虹光化工厂

次甲基蓝（分析纯）               天津市科密欧化学试剂开发中心

乳酸脱氢酶（分析纯，≥30U/mg ）  上海三杰生物技术有限公司

还原性辅酶Ⅰ（分析纯, ≥99%）      上海三杰生物技术有限公司

NDJ—79型旋转粘度计             同济大学机械厂

全自动生物反应器MSJ-u3          B.E.MARUBISHICO.LTD.，JAPAN；

752 型紫外可见分光光度计         上海菁华科技仪器有限公司

HH-S11-N15 型电热恒温水浴锅     龙口市先科仪器公司

ZD-2 型自动电位滴定仪            上海精密科学仪器有限公司

4.2.3 培养基

菌种斜面培养基（g/L）：淀粉 5.0，牛肉膏 3.0，NaCl5.0，蛋白胨 10.0，琼脂 15.0～20.0，pH 值7.4。

菌种扩大培养基（g/L）：（NH4）2SO4 1g/L，MgSO4 0.12g/L，CaCO3 2g/L，酵母浸粉2.4g/L， 淀粉10.6g/L，葡萄糖2.1g/L，初始pH7.4。

发酵培养基（g/L）：淀粉40g/L，豆粉6g/L，CaCO3 2g/L，初始pH7.4。

4.2.4 生物反应器及其运行条件

生物反应器及其运行条件：反应器的有效容积为30L，配备有两层搅拌桨，T/D=0.5，D=0.3m； 发酵液的溶氧浓度 DO 值采用原电池型溶氧电极插于两层搅拌桨之间自动检测；采用 1%的 H2SO4 溶液和1%的NaOH溶液自动控制调节发酵液的pH值；发酵温度26℃，转速800r/min， 通气比为1:1vvm，发酵周期90小时。

4.2.5 分析方法及原理

4.2.5.1 发酵液粘度的测定

用NDJ—1型旋转粘度计，室温，30rpm 下测定。

4.2.5.2 黄原胶浓度的测定

工业乙醇（95%）沉淀出胶体，洗涤后70℃真空干燥后称重。

4.2.5.3 发酵液中菌体浓度的测定

分光光度计650nm处测定OD值。

4.2.5.4 还原糖、淀粉浓度的测定     

还原糖及淀粉浓度测定的原理[27]：

淀粉经酸或酶水解生成葡萄糖：

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所生成的葡萄糖用斐林试剂测定。 斐林试剂由甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时 甲、乙液分别贮存，测定时甲、乙液等体积混合。混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：

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所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钾钠铜络合物，使氢氧化铜溶解：67d398a28cd57.png

酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂，能使还原糖中羰基氧化，而二价铜被还原生 成一价的氧化亚铜沉淀：

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反应终点用次甲基蓝指示剂显示。因次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜被还原后， 过量一滴还原糖立即使次甲基蓝还原，溶液蓝色消失以示终点。

具体测定方法：

a.斐林试剂的标定 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，加入20毫升水， 并从滴定管中预先加入约24毫升0.2%标准葡萄糖溶液，摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸 2分钟。加2滴1%次甲基蓝溶液，以4～5秒钟1滴的速度继续用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至 蓝色消失。此滴定操作需在1分钟内完成，其消耗0.2%标准葡萄糖溶液应该控制在1毫升以内。 总耗糖量为V0毫升。

b.试样水解 称取黄原胶发酵液5g，置入250毫升三角瓶中，加入100毫升1:4盐酸溶液，瓶 口按上回流冷凝器或长玻璃管，于沸水浴中回流水解半小时。取出，迅速冷却，并用 20%氢氧 化钠溶液中和至中性或微酸性。脱脂棉过滤，滤液用500毫升容量瓶接收。用水充分洗涤残渣， 然后用水定容至刻度，摇匀，为供糖试液。

c.定糖：

预备试验 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，准确加入20毫升水 解糖液，摇匀，于电炉上加热至沸，加2滴1%次甲基蓝溶液，用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至 蓝色消失。耗糖量为V1毫升。

正式试验 吸取斐林试剂甲、乙液各5毫升，置入250毫升三角瓶中，准确加入20毫升水 解糖液，补加约（V0- V1）毫升水，并从滴定管中预先加入约（V1-1）毫升 0.2%标准葡萄糖溶液， 摇匀，于电炉砂锅内加热至沸，并保持微沸2分钟。加2滴1%次甲基蓝溶液，以4～5秒钟1 滴的速度继续用0.2%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失。其消耗0.2%标准葡萄糖溶液应该控制在 1毫升以内。总耗糖量为V毫升。

d.计算

淀粉（%）=（V0-V）*C*500/20*1/W*0.9*100%

式中 V0——斐林试剂标定值（毫升）

 V——斐林试剂测定值（毫升）

C——标准葡萄糖溶液浓度（克/毫升）

W——试样重量（克）

500/20——20 为测定时所取水解糖液体积，500为水解糖液总体积（毫升）

4.2.5.6 黄原胶中丙酮酸含量的测定

Duckworth 和Yaphe 的酶法测定丙酮酸含量的原理[28] 黄原胶经酸水解可释放分子组成中的丙酮酸，丙酮酸可进行如下酶促反应：

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NADH在340nm处有最大吸收峰，而NAD 没有吸收峰。在340nm处测定吸收值的变化即可定量求出丙酮酸含量

精确称取黄原胶5mg，置于2ml 1mol/L的HCl中，100℃水解3h后，加入2ml 2mol/L Na2CO3 溶液中和，用水稀释至10ml，取 2ml稀释液至1cm的石英杯中，加入1ml 1mol/L三乙醇胺缓冲 液，50µl还原型辅酶Ⅰ(10mg/ml，溶剂为 1% NaHCO2)，340nm波长下测吸光度(A1)，再加 6µ乳酸脱氢酶(272U/mg)，5min后测吸光度，此后每隔1min测一次，直至数值稳定，此吸光度值 为A2。以下列公式计算丙酮酸含量：

丙酮酸(%) =5×88×100 (A1- A2) ×3.05样品质量/Sw/6.22/1000

其中：5 为稀释倍数，88 为丙酮酸的分子量, 3.05 为溶液体积, Sw为黄原胶样品重量（mg）, 6.22 为还原型辅酶I(NADH)的毫摩尔吸光系数。

4.2.6 反应器内部结构

4.2.6.1 搅拌器的型式

新型组合搅拌器和传统搅拌器的结构及其流场描述如图4.1和4.2所示：

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4.2.6.2 挡板型式

采用全深型挡板，窄挡板宽度为20mm，宽挡板宽度为34mm。

4.3 实验结果及讨论

4.3.1 不同桨型组合对发酵的影响

4.3.1.1 不同搅拌桨对发酵液黄原胶浓度的影响

图4.3 可见，新桨（以下称改进桨）体系下黄原胶稳定产胶期提前，整个发酵过程中黄原胶 浓度始终高于原桨（以下称传统桨）体系。改进桨的上层采用下压式双折叶圆盘涡轮、下层采 用六叶布鲁马金，两种桨都能在产生径向流的同时又能产生轴向流，尤其是布鲁马金属于剪切 循环兼顾型叶轮，适用于既需要一定剪切、又需要高循环的场合，而下压式双折叶圆盘涡轮在 产生很强剪切流的同时又能产生一定的轴向流，强化了混合效果，较好地满足了黄原胶发酵液 对较大流动循环量的需求，改善了反应器内部的传质混合效果。

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黄原胶属次生代谢产物，发酵动力学为菌株生长与产物合成非偶联类型，与抗生素和微生 物毒素等物质合成代谢类似，代谢产物的合成是在菌体浓度接近或达到最高后才开始的[29]。改 进桨体系下良好的传质混合效果缩短了菌体的增殖期，发酵液中黄原胶浓度的稳定增长期提前， 明显早于传统桨体系。黄原胶发酵过程初期表现为低粘度的牛顿体系，随着产物的形成和积累， 发酵液粘度渐增，在后期呈现为高粘度的假塑性非牛顿体系，限制了氧的传递和其他营养物质 的交换，影响黄原胶产量的进一步提高。78 小时后发酵液中黄原胶浓度继续增加，改进桨体系 下黄原胶浓度的增长幅度高于传统桨。改进桨组合较好的气液分散效果，较高的气含率，较大 的传质系数，气体在罐内较长的停留时间，在一定程度上克服了发酵后期存在的上述问题。

4.3.1.2 不同搅拌桨对发酵液粘度的影响

图4.4 可见，改进桨体系下发酵中后期黄原胶发酵液的粘度高于传统桨体系发酵液的粘度。通常黄原胶发酵液的粘度与黄原胶的浓度、平均分子量之间有着正相关的关系。对照图4.3可以 看出，改进桨体系下发酵液中黄原胶浓度的增加与其粘度的增加均高于传统桨体系，根据黄原 胶发酵液粘度与黄原胶浓度、平均分子量间的正相关关系，只有在平均分子量没有降低的条件 下，黄原胶发酵液的粘度才会随其浓度的增加而增加，而改进桨体系下发酵液中黄原胶浓度与 其粘度的同时增加也正说明了在此桨体系下并没有使黄原胶的平均分子量降低。

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4.3.1.3 搅拌对发酵液中碳源浓度的影响

图4.5可见，改进桨体系下最终发酵液中淀粉浓度低于传统桨体系，而葡萄糖浓度基本相同。 碳源不仅是合成黄原胶的基质，也是菌体增殖的物质基础，黄原胶的产量与碳源种类和底物浓 度有着直接的关系。通常发酵液中淀粉浓度、葡萄糖浓度、产物的浓度之间存在着一种动态平 衡。以淀粉质为原料的黄原胶发酵初始，由于淀粉的液化，培养基中存在少量的葡萄糖，此后 随着菌体的迅速繁殖，其分泌的胞外淀粉酶活力也随着增加，淀粉被逐渐水解为葡萄糖，发酵 液中淀粉浓度随之降低，葡萄糖浓度增加。

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改进桨体系下前36小时淀粉浓度下降迅速，相对应的葡萄糖浓度在此段时间内出现了最大 值，而传统桨体系下则无此明显下降趋势，淀粉浓度始终处于改进桨之上，葡萄糖浓度亦低于 改进桨体系。36小时后菌体增殖缓慢，甚至停止增殖，菌体由生长型转为产物积累型，淀粉继 续被胞外淀粉酶水解成葡萄糖，此时大量的葡萄糖被用于黄原胶的生物合成，至到发酵结束。

在任何微生物发酵过程中，根据生物反应动力学原理，当发酵液中的底物下降到一定浓度 时，菌体代谢速率非常缓慢，在工业生产中可以结束发酵。本研究中黄原胶发酵结束时改进桨 体系与传统桨体系发酵液中的残糖含量基本相同，均下降到0.5%以下。但是，对照图4.3 可以 看出，改进桨体系下发酵液中的黄原胶浓度明显的高于传统桨体系，那么合成这部分黄原胶的 底物葡萄糖来自于哪里？对照图4.5可以看出，改进桨体系下发酵液中残留淀粉浓度始终低于传 统桨体系，直到发酵结束。这是由于改进桨良好的混合传质效果，强化了胞外淀粉酶与底物淀 粉的充分接触，有利于淀粉的快速水解，也就是说，改进桨体系条件下多合成的这部分黄原胶 所需要的葡萄糖正是来自于良好的淀粉水解。培养基中的淀粉最大程度的水解为合成黄原胶所 需要的葡萄糖，既有利于黄原胶产率的提高，又有利于黄原胶的提取。

4.3.1.4 不同桨型组合对于发酵液混合的影响

在黄原胶的生物发酵过程中，由于黄原胶具有高粘度的特性，不但导致了其发酵中后期粘 度过大，给发酵过程中氧的传递、气液混合以及热量的传递等带来了很大的困难[30]，而且在靠 近反应器内壁处还存在一个基本上静止不动的发酵液区域，在此区域内，氧和其他营养物质的 传递、交换更为困难，导致了细胞活力的下降甚至细胞死亡。研究表明，发酵结束后，无论是 在改进桨体系下还是在传统桨体系下，运动区与静止区的发酵液中黄原胶浓度、粘度、残糖浓 度等各项参数都有着明显的差异，见表4.1。

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表1数据表明，无论是在改进桨体系下还是在传统桨体系下，发酵中后期均有发酵液静止区 出现，而且其体积均随发酵的进行而增大；运动区发酵液中黄原胶浓度、粘度、丙酮酸的含量 始终高于静止区，而葡萄糖含量和淀粉含量则低于静止区，运动区黄原胶的综合指标明显高于静止区。

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搅拌操作时，用搅拌器对低粘度互溶液造成湍流并不困难，但粘度达到较高水平后，由于 粘滞力的影响，就只能出现层流状态。尤其困难的是，这种层流也只能出现在搅拌器附近，离桨叶稍远些地方的高粘度液体仍是静止的。这样就很难造成液体在搅拌设备内的循环流动，即 在设备内会有死区存在，对混合、分散、传热、反应等各种搅拌过程十分不利。所以高粘度液 体搅拌的首要问题就是要解决流体流动与循环的问题，设法使搅拌器推动更大范围的液体[31]。 如图4.7所示，改进桨体系由于较大的轴向循环量推动了更大范围的液体，促进了反应器内部的 总体混合，其静止区明显减少。评价任何生物反应过程，其最终的产率或者底物—产物转化率 都是一个重要指标，甚至是决定性指标。如上所述改进桨能提高黄原胶发酵液的浓度，必然增 加了黄原胶的糖胶转化率，同时又由于其静止区的体积减少，也带来了黄原胶产率的增加，并 且提高了高质量黄原胶的含量。因此可以说这种桨型组合应用于黄原胶等高粘性物系的发酵， 在一定程度上能够克服发酵后期粘度过高而带来的氧和其他营养物质的传递、交换困难的难题， 适合于高粘性物系的发酵。

4.3.2 档板尺寸对发酵过程的影响

4.3.2.1 档板对菌体生长的影响

黄原胶发酵过程中发酵液的吸光度光度值随时间不断变化，发酵液吸光度的变化可以看作 是其中菌体量的变化，故吸光度随时间的变化曲线可以看作是菌体的生长曲线，体现发酵过程 中菌体的生长情况[32]。图 4.8可见，原挡板条件下，菌体生长曲线随发酵时间不断上升，没有明 显的对数生长期和稳定期；无挡板和窄挡板条件下，菌体生长曲线符合正态分布，与微生物的 典型生长曲线完全相符。挡板的设置有利于增加流体的湍动效果，同时也对流体产生了相当大 的剪切力。原挡板条件下发酵液受到的剪切力相对于无挡板条件和窄挡板条件要大，而黄单胞杆菌作为一种较为脆弱的菌体，生长初期对环境的剪切作用非常敏感，因此原挡板条件下菌体 的生长情况明显差于无挡板条件和窄挡板条件。

黄原胶属次生代谢产物，其发酵动力学为菌株生长与产物合成非偶联类型， 代谢产物的合 成是在菌体浓度接近或达到最高后才开始的[33]。为获得高产，培养条件要求短的对数生长期和 长的稳定期，或降低对数生长期的生长率，已提早形成次级代谢产物，原挡板条件不利于黄原 胶产物的获得。

4.3.2.2 档板对发酵的影响

对发酵过程中黄原胶的浓度、粘度、以及发酵液中葡萄糖和淀粉含量进行了测定，对这些 参数与它们的发酵时间作图，分析挡板对发酵的影响，见图4.9、4.10、4.11、4.12。

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上述各项数据表明：对于黄原胶发酵，在改进桨体系下，窄挡板和无挡板条件下发酵液中 黄原胶浓度和粘度明显高于原挡板条件；发酵结束时窄挡板和无挡板条件下葡萄糖含量和淀粉 含量亦明显低于原挡板条件。对于窄挡板和无挡板这两种状态，无挡板条件下发酵液静止区的 体积小于窄挡板条件，并且发酵液静止区体积的大小与挡板宽度之间还存在着正相关的关系， 挡板越宽，其静止区体积越大。

通常，对于低粘度物系，为了消除搅拌容器内液体的打旋现象，使被搅物料能够上下轴向 流动，需要在搅拌容器内加入若干块挡板。安装在筒体内壁的挡板可把回转的切向流动改变为 径向和轴向流，较大地增加了流体的剪切强度，增大湍动程度，改善主体循环，促进全釜的均 匀混合；同时还能降低搅拌载荷的波动，使功率消耗保持稳定。但是，许多研究表明，当物料 的粘度增加时，挡板的宽度可相应的减少，当粘度达到10Pa·S时，可以不再按装挡板[34]。对于 黄原胶这种高粘性物系，在发酵初期，由于没有黄原胶产生或产生的量很少，发酵液的粘度较低，搅拌器很容易在全罐内形成湍流，从而达到全罐的混合。但是随着发酵的进行，黄原胶浓 度不断增大，发酵液变得越来越粘稠，搅拌器的工作状态逐渐由湍流域转变为过渡流域或层流 域，这时仅叶轮周围的液体随叶轮旋转。由于粘滞力的影响，随着离搅拌器距离的增加，流体 速度下降得越来越明显，此时罐壁处的发酵液流速更小。当在罐壁处加装挡板后，以较低速度 运动的发酵液迅速在挡板前后形成停滞区域，此时挡板的存在严重影响了全罐的混合，这对黄 原胶的发酵生产是十分不利的。因此，缩小挡板宽度或将挡板拆除后，相对于原有挡板条件下 发酵液更容易形成规整的循环流，有利于整个发酵液的均匀混合，适合于黄原胶这种高粘性物系的发酵。这一研究结果，与李卫旗，姚恕[35]研究的在传统平叶搅拌器发酵设备中适当减小挡 板数目或不设挡板更有利于黄原胶高粘性物系发酵的研究结果一致。

4.4 小结

本章在最佳发酵工艺条件下，针对新的桨型组合对发酵过程的影响、挡板对发酵过程的影 响进行了研究。研究结果表明，新的桨型组合在保持好的径向气体分散能力的同时，加强了轴 向循环混合的能力，明显改善了反应器内部混合状态，具有以下明显的优点：

（1）新型桨组合较大的流动循环量、优良的传质混合效果缩短了黄原胶进入稳定产胶期所需的 时间。

（2）新型桨组合提高了整个发酵过程黄原胶的浓度，提高了发酵液的粘度，

（3）改进桨组合较高的传质系数、较好的宏观稳定流型提高了碳源的利用率，减少了最终发酵 液中淀粉的残留量，降低了后提取工艺的难度与能源消耗。

（4）新型桨组合较强的搅拌混合效果降低了静止区的厚度，促进了氧的传递，增强了营养物质 的交换，提高了发酵液中黄原胶的浓度和质量。

对于黄原胶发酵体系，采用窄挡板或无挡板的釜内结构形式有利于物料混合，提高发酵过程效率。

五、结论与展望

5.1 结论

（1）黄原胶发酵过程由菌体的生长代谢阶段和产物的合成阶段组成；XG-101 黄单胞杆菌发酵 生产黄原胶的最佳培养基配方：淀粉 0.4g/L，豆粉 0.06g/L，碳酸钙 0.02g/L；α-淀粉酶活力 20000U/ml 时，用量0.25U/淀粉，液化2分钟时发酵液中黄原胶的浓度最高；最佳发酵条件：温 度26℃、通风比为1：1 vvm、搅拌转速800r/min。

（2）下压式双折叶圆盘涡轮与六叶布鲁金桨组合在具有较高气含率及容积氧传质系数的同时功 耗较低，具有较好的搅拌混合效果，有利于解决黄原胶发酵后期粘度过高所引起的传质混合困 难等问题。

（3）采用下压式双折叶圆盘涡轮与六叶布鲁金桨组合，缩小挡板尺寸或拆除挡板，可以在保持 好的径向气体分散能力的同时，加强了轴向循环混合的能力，明显改善了反应器内部混合状态， 缩短了黄原胶进入稳定产胶期所需的时间、提高了发酵液中黄原胶的浓度和质量以及发酵液的 粘度、减少了最终发酵液中淀粉的残留量，降低了后提取工艺的难度与能源消耗。

5.2 展望

高粘度、低溶氧浓度始终是困扰黄原胶生产的一个问题, 间歇法发酵设备主要是带搅拌的 反应器，它是目前唯一工业化的设备。工业生产黄原胶大都在机械搅拌发酵反应器内进行，由 于发酵液的高粘度和强假塑性而是发酵罐内出现大量的死区，造成黄原胶发酵周期长，产胶浓 度低、能耗高，因此开发新型的适用于黄原胶发酵过程的生物反应器就显得特别重要。所谓反 应器的选择也就是搅拌桨形式的选择，本实验室将在上述实验结果的基础上继续研究新的桨型、 改变桨型组合层数、并考察反应器内部构件对黄原胶发酵的影响，开发适合于黄原胶等高粘性 物系发酵的新型生物反应器，将其应用于黄原胶热膜发酵进行检验。


图文来源 | XG-101黄单胞杆菌发酵生产黄原胶的研究

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