为什么要进行菌株分离培养？

从特定环境中分离细菌是微生物研究中的一个基本且重要的步骤，尤其对于研一新生来说，这通常是一个很好的入门实践，那为什么要不断的从某种环境下分离细菌呢？我个人认为可以做以下几方面的归纳：

（1）宿主特异性：植物和微生物之间通过复杂的化学信号进行交流，这些信号包括根系分泌物、植物激素等。不同的植物种类可能会释放不同类型的化学物质，从而吸引或抑制特定的微生物群落。比如，从玉米根际分离出的PGPR对玉米的促生效果要远远好过其他作物。另外不同生态系统间环境的巨大差异也会影响到PGPR的作用效果，如许多在陆地作物上表现优良的菌株可能根本就无法在海洋环境中生存（盐度的巨大差异），所以建立针对你研究物种的菌种资源库是必要且重要的。

（2）环境适应性与功能性：不同地区的土壤条件（pH值、有机质含量、温度等）、作物类型及耕作方式都会影响当地PGPR的组成。因此，直接从目标区域采集样品进行分菌有助于找到最适合该环境下使用的高效菌株。随着气候变化等因素的影响，生态系统也在不断地发生变化。定期从自然环境中重新分离PGPR可以帮助研究人员及时掌握最新情况，并开发出能够更好地适应当前条件的产品。

（3）应对菌株功能退化：长期培养过程中，由于实验室条件下的人工选择压力等原因，可能会导致PGPR菌株发生遗传变异甚至丧失原有的有益特性。定期从自然界重新获取新鲜样本有助于保持菌群的遗传多样性，并减少因过度驯化而引起的功能衰退现象。这一点非常重要，简单打个比方就是菌A刚分离培养出来后溶磷量可以达到300mg/L，但如果多次传代培养或者放在-80℃保存多年，其溶磷能力可能会大大降低。

如何进行菌株的分离培养？

总体来说，菌株的分离培养是个简单但非常非常耗时的一件事，在进行菌株分离培养时需要注意的地方略作以下总结：

01无菌操作

所有操作都应在无菌条件下进行，使用高温高压灭菌、火焰灭菌或紫外线照射来保持工作台面、工具及器皿的无菌状态。穿戴适当的个人防护装备，如实验室服、手套和口罩等。

02培养基的选择

根据目标微生物的营养需求选择合适的培养基。对于PGPR来说，可能需要特定类型的碳源、氮源以及其他微量元素。如果目的是筛选具有抗性的菌株，则可以在培养基中加入适量的抗生素；反之则应避免不必要的抗生素使用以免影响非目标菌群。

我主要做海草根际潜在促生菌的筛选，培养基选择用了专门针对海洋环境的2216E培养基、10"16E培养基（高营养条件下可能会导致快速生长的非目标微生物迅速占据主导地位，从而抑制了较慢生长的目标PGPR的发展。通过降低营养水平，可以减少这种竞争压力）、Ashby培养基、溶磷培养基、高氏一号培养基、芽孢杆菌培养基、R2A培养基等[注意NaCl要加到符合海洋环境的量]。不同培养基可以有利于不同种类细菌的生长，因此建议多用一些不同类型的培养基。另外，能买则买，现在很多成品培养基可以直接用，自己去挨个配特别特别浪费时间。

03样品处理

简单来说就是制备菌悬液，然后涂布，培养（倒置、第一次可以7-10天，让生长缓慢的菌长起来，特殊情况下可继续延长培养时间），挑取菌落反复划线直到得到纯培养物。值得注意的是：（1）用2216E或者LB培养基的用10^-5、10^-6土样稀释液涂布，而用选择性培养基的则用10^-3、10^-4土样稀释液涂布即可。（2）可用涂布棒也可以用玻璃珠，小红书上有好多教程，可以搜一下，研究生们真的很聪明。（3）看文献一般都会说“根据菌落的颜色、透明度、大小、边缘是否规则、湿润或干燥、菌落是否突起等用接种环挑取不同特征的菌落在新的平板中划线分离后再次至于培养箱中培养”，其实很多菌株非常非常的相似，肉眼根本就看不出差异。所以第一次分菌挑单菌落的时候我就很为难，长得都一样可咋办，没事，长得都一样也挑出来划线回头再鉴定就行了，大胆做，多挑，不然会错过很多菌菌子。对了，平板也要买一次性的，会用很多，如果用玻璃的每次还得刷，灭菌，烘干，心情会变差很多，主人心情不好菌菌子也不会好好长。

04菌种保存

一般来说获得单菌落后就要及时把菌种保存起来。平板上的菌菌子放在4℃冷藏箱里不要超过1个月，甘油保存在-80℃冰箱里据说3-5年没有问题，但是也确实存在一些菌无法复苏的情况。

甘油保存的一般步骤：（1）挑取单菌落至2216E/LB培养基（根据你自己的培养基定）中，培养至对数生长期（其实一般过夜后浑浊就差不多，有的菌长得慢就多培养会）；（2）用甘油和超纯水1：1混合，将50%的甘油用作保种液；（3）吸取800ul的保种液和800ul菌液1：1于灭菌保种管内，写好编号放入-80℃冰箱中。

别掉书袋子里，比如甘油就一定要和超纯水一起么？不是的，换成NaCl水溶液或者培养基都行；保种液也不一定非得50%的甘油，60%也行。不要纠结这些，按照自己实验室的传统做就行，如果没有传统就按我这个做哈哈哈哈。

05菌株鉴定

一般步骤就是提DNA，PCR，送测，拼接，Blast比对。测序结果的拼接、比对以后再整理今天介绍菌株DNA的提取和PCR，方法的传承要特别鸣谢我的好友王雪洁。DNA的提取可以用试剂盒，步骤说明书上都写得很清楚，这里就不介绍了，今天要介绍一个简单的方法--煮沸法（Boiling Method），这是一种简单快速的DNA提取方法，常用于小规模实验室操作，尤其是当需要快速获取少量DNA样本进行初步分析时，这种方法特别适用于单个菌落的DNA提取。

煮沸法提取DNA基于高温破坏细胞壁和细胞膜的原理。在煮沸过程中，高温使得细菌细胞壁（主要由肽聚糖构成）和细胞膜中的脂质发生变性，从而使细胞内容物包括DNA释放出来。但是，值得注意的是并非所有的微生物都适合用煮沸法提取DNA，特别是那些具有特殊细胞壁结构（如某些革兰氏阳性菌）的微生物，可能需要更加温和的方法或者额外的裂解步骤。 

DNA提取步骤如下：（1）在1.5ml无菌无酶EP管中加入200ulTE（1%），直接买现成的即用型TE即可；（2）10ul枪头刮取单菌落，将枪头一并打入EP管中，涡旋混匀一下；（3）EP管放在浮漂上，煮沸10min；（4）-20℃保存30min以上

PCR步骤：（1）准备药品，依次加入Mix酶（15ul/份），ddwater（13.4ul/份），双向引物（0.3ul/份）；（2）取29ul母液于EP管中，在冰上加入1ul DNA模板；（3）放入PCR仪，设置预变形94℃ 5min、变性94℃ 1min、退火55℃ 1min、延伸72℃ 1.5min、再延伸72℃ 10min，30循环。注意，pcr扩增具体条件要根据所有的酶、引物确定，有钱的就用高保真酶，手头不宽裕的就用普通酶，问题不大。1ul的DNA模板，可以打在PCR小管的壁上，然后用离心机转一下就可以了，也不一定非得1ul，有一次我忘了调枪用了2.5ul也可以，所以说也不是非得那么严格（严格没有错，但是如果你像我一样忘了调枪多加了一点也是没关系的）。

为什么要进行菌株分离培养？

从特定环境中分离细菌是微生物研究中的一个基本且重要的步骤，尤其对于研一新生来说，这通常是一个很好的入门实践，那为什么要不断的从某种环境下分离细菌呢？我个人认为可以做以下几方面的归纳：

（1）宿主特异性：植物和微生物之间通过复杂的化学信号进行交流，这些信号包括根系分泌物、植物激素等。不同的植物种类可能会释放不同类型的化学物质，从而吸引或抑制特定的微生物群落。比如，从玉米根际分离出的PGPR对玉米的促生效果要远远好过其他作物。另外不同生态系统间环境的巨大差异也会影响到PGPR的作用效果，如许多在陆地作物上表现优良的菌株可能根本就无法在海洋环境中生存（盐度的巨大差异），所以建立针对你研究物种的菌种资源库是必要且重要的。

（2）环境适应性与功能性：不同地区的土壤条件（pH值、有机质含量、温度等）、作物类型及耕作方式都会影响当地PGPR的组成。因此，直接从目标区域采集样品进行分菌有助于找到最适合该环境下使用的高效菌株。随着气候变化等因素的影响，生态系统也在不断地发生变化。定期从自然环境中重新分离PGPR可以帮助研究人员及时掌握最新情况，并开发出能够更好地适应当前条件的产品。

（3）应对菌株功能退化：长期培养过程中，由于实验室条件下的人工选择压力等原因，可能会导致PGPR菌株发生遗传变异甚至丧失原有的有益特性。定期从自然界重新获取新鲜样本有助于保持菌群的遗传多样性，并减少因过度驯化而引起的功能衰退现象。这一点非常重要，简单打个比方就是菌A刚分离培养出来后溶磷量可以达到300mg/L，但如果多次传代培养或者放在-80℃保存多年，其溶磷能力可能会大大降低。

如何进行菌株的分离培养？

总体来说，菌株的分离培养是个简单但非常非常耗时的一件事，在进行菌株分离培养时需要注意的地方略作以下总结：

01无菌操作

所有操作都应在无菌条件下进行，使用高温高压灭菌、火焰灭菌或紫外线照射来保持工作台面、工具及器皿的无菌状态。穿戴适当的个人防护装备，如实验室服、手套和口罩等。

02培养基的选择

根据目标微生物的营养需求选择合适的培养基。对于PGPR来说，可能需要特定类型的碳源、氮源以及其他微量元素。如果目的是筛选具有抗性的菌株，则可以在培养基中加入适量的抗生素；反之则应避免不必要的抗生素使用以免影响非目标菌群。

我主要做海草根际潜在促生菌的筛选，培养基选择用了专门针对海洋环境的2216E培养基、10"16E培养基（高营养条件下可能会导致快速生长的非目标微生物迅速占据主导地位，从而抑制了较慢生长的目标PGPR的发展。通过降低营养水平，可以减少这种竞争压力）、Ashby培养基、溶磷培养基、高氏一号培养基、芽孢杆菌培养基、R2A培养基等[注意NaCl要加到符合海洋环境的量]。不同培养基可以有利于不同种类细菌的生长，因此建议多用一些不同类型的培养基。另外，能买则买，现在很多成品培养基可以直接用，自己去挨个配特别特别浪费时间。

03样品处理

简单来说就是制备菌悬液，然后涂布，培养（倒置、第一次可以7-10天，让生长缓慢的菌长起来，特殊情况下可继续延长培养时间），挑取菌落反复划线直到得到纯培养物。值得注意的是：（1）用2216E或者LB培养基的用10^-5、10^-6土样稀释液涂布，而用选择性培养基的则用10^-3、10^-4土样稀释液涂布即可。（2）可用涂布棒也可以用玻璃珠，小红书上有好多教程，可以搜一下，研究生们真的很聪明。（3）看文献一般都会说“根据菌落的颜色、透明度、大小、边缘是否规则、湿润或干燥、菌落是否突起等用接种环挑取不同特征的菌落在新的平板中划线分离后再次至于培养箱中培养”，其实很多菌株非常非常的相似，肉眼根本就看不出差异。所以第一次分菌挑单菌落的时候我就很为难，长得都一样可咋办，没事，长得都一样也挑出来划线回头再鉴定就行了，大胆做，多挑，不然会错过很多菌菌子。对了，平板也要买一次性的，会用很多，如果用玻璃的每次还得刷，灭菌，烘干，心情会变差很多，主人心情不好菌菌子也不会好好长。

04菌种保存

一般来说获得单菌落后就要及时把菌种保存起来。平板上的菌菌子放在4℃冷藏箱里不要超过1个月，甘油保存在-80℃冰箱里据说3-5年没有问题，但是也确实存在一些菌无法复苏的情况。

甘油保存的一般步骤：（1）挑取单菌落至2216E/LB培养基（根据你自己的培养基定）中，培养至对数生长期（其实一般过夜后浑浊就差不多，有的菌长得慢就多培养会）；（2）用甘油和超纯水1：1混合，将50%的甘油用作保种液；（3）吸取800ul的保种液和800ul菌液1：1于灭菌保种管内，写好编号放入-80℃冰箱中。

别掉书袋子里，比如甘油就一定要和超纯水一起么？不是的，换成NaCl水溶液或者培养基都行；保种液也不一定非得50%的甘油，60%也行。不要纠结这些，按照自己实验室的传统做就行，如果没有传统就按我这个做哈哈哈哈。

05菌株鉴定

一般步骤就是提DNA，PCR，送测，拼接，Blast比对。测序结果的拼接、比对以后再整理今天介绍菌株DNA的提取和PCR，方法的传承要特别鸣谢我的好友王雪洁。DNA的提取可以用试剂盒，步骤说明书上都写得很清楚，这里就不介绍了，今天要介绍一个简单的方法--煮沸法（Boiling Method），这是一种简单快速的DNA提取方法，常用于小规模实验室操作，尤其是当需要快速获取少量DNA样本进行初步分析时，这种方法特别适用于单个菌落的DNA提取。

煮沸法提取DNA基于高温破坏细胞壁和细胞膜的原理。在煮沸过程中，高温使得细菌细胞壁（主要由肽聚糖构成）和细胞膜中的脂质发生变性，从而使细胞内容物包括DNA释放出来。但是，值得注意的是并非所有的微生物都适合用煮沸法提取DNA，特别是那些具有特殊细胞壁结构（如某些革兰氏阳性菌）的微生物，可能需要更加温和的方法或者额外的裂解步骤。 

DNA提取步骤如下：（1）在1.5ml无菌无酶EP管中加入200ulTE（1%），直接买现成的即用型TE即可；（2）10ul枪头刮取单菌落，将枪头一并打入EP管中，涡旋混匀一下；（3）EP管放在浮漂上，煮沸10min；（4）-20℃保存30min以上

PCR步骤：（1）准备药品，依次加入Mix酶（15ul/份），ddwater（13.4ul/份），双向引物（0.3ul/份）；（2）取29ul母液于EP管中，在冰上加入1ul DNA模板；（3）放入PCR仪，设置预变形94℃ 5min、变性94℃ 1min、退火55℃ 1min、延伸72℃ 1.5min、再延伸72℃ 10min，30循环。注意，pcr扩增具体条件要根据所有的酶、引物确定，有钱的就用高保真酶，手头不宽裕的就用普通酶，问题不大。1ul的DNA模板，可以打在PCR小管的壁上，然后用离心机转一下就可以了，也不一定非得1ul，有一次我忘了调枪用了2.5ul也可以，所以说也不是非得那么严格（严格没有错，但是如果你像我一样忘了调枪多加了一点也是没关系的）。