牛精液冷冻与人工授精技术相结合，在牛品种改良、保护优良种质资源中发挥着重要作用。随着畜牧业的蓬勃发展，冷冻精液在生产实践中的应用变得尤为重要，而冻后精液的质量则是重中之重。精液的冷冻保存技术一直被认为是动物育种的重要手段之一，在保护濒危物种及攻克男性不育方面做出了突出贡献。

精液的冷冻保存至今已有200多年的历史，早在1787年，生物学家Spallanzani第一次报道冷冻保存在冰雪中的人和马的精液解冻后仍有少量的精子存活。1938年，Janell发现储存于-79℃玻璃管中的精液，40天后复温部分精子仍具有活力。1940年，Shettles将精液置于毛细玻璃管中并放在-196℃储存，发现解冻后精子的存活率达到10%。但是直到1949年，Polge等将甘油用作哺乳动物精子、其他体细胞和组织的冷冻保护剂，低温冷冻技术才真正发展起来。1950年，英国的瑞丁动物人工授精研究中心，用牛冷冻精液进行人工授精后，成功地诞下牛犊，这是世界上第一个应用冷冻精液产生的哺乳动物。之后，各种动物精液的冷冻保存研究得到了蓬勃的发展并取得成功。

精液低温保存的原理是利用含有冷冻保护剂的稀释液将精子进行冷冻，使细胞的冰点降低，防止精子在冷冻过程中发生细胞严重脱水而导致冰晶形成，同时采取合适的降温速率，使精子顺利进入液氮的安全区。处于超低温状态下的精子代谢活动受到完全抑制，能量消耗停止，可以达到长期保存的目的，升温解冻后其受精能力恢复。标准化的精液冷冻程序如图1所示，包括精液采集、精液密度检测、精子活力检测、稀释罐装、冷冻和包装等部分。

精子的冷冻保存要经过降温、细胞脱水、冷冻、冻存以及解冻等一系列复杂的过程。精子细胞与体内其他细胞相比，水分含量低膜流动性高，耐冻能力更强，但是精液的冷冻-解冻过程引起精子膜结构与功能以及细胞代谢的改变，造成精子完整性受损。降温会引起精子细胞代谢紊乱、离子失衡、蛋白酶激活，造成细胞酸化毒性、能量消耗、膜的相变、胞质的不稳定、生成过量的自由基和活性氧；冷冻过程中，精子受到的损伤主要来自于胞内冰晶的形成、渗透压的升高、细胞的脱水以及蛋白质的变性。冷冻保存造成的精子损伤主要包括（图2）精子顶体完整性损伤、质膜完整性损伤、线粒体完整性损伤、氧化应激损伤以及遗传物质的损伤等。

提高冷冻精子质量的方法主要包括添加冷冻保护剂、优化冷冻方法以及添加抗氧化剂。精液冷冻稀释液的各种组分都是被系统研究过的，通常包括缓冲液（Tris碱）、一种或多种糖（葡萄糖、乳糖、棉子糖、蔗糖或海藻糖）、盐（柠檬酸钠、柠檬酸）、抗生素（青霉素、链霉素）以及冷冻保护剂。冷冻保护剂通常被分为渗透性冷冻保护剂（甘油、乙二醇、DMSO等）和非渗透性冷冻保护剂（牛奶、卵黄等）。目前常规精子冷冻技术主要包括慢速冷冻、快速冷冻以及可程序冷冻。最常用的是程序冷冻法，其简单易操作，但是设备价格昂贵，运行成本高。

在精液冷冻稀释液中补充抗氧化剂可改善冻后精子活力、膜完整性和可育性，是目前研究最多最有效的方法。抗氧化剂依据其化学结构可分为两类，即酶促和非酶促。酶促抗氧化剂包括GPX、SOD和CAT等。非酶类抗氧化剂主要是自由基清除剂，例如维生素E（α-生育酚）、维生素C（抗坏血酸）、褪黑素、GSH、牛磺酸以及酶促抗氧化剂的辅因子，例如硒或锌，形成抵抗自由基的防御系统。很多天然草药的提取物也可以用作抗氧化剂，例如金雀异黄素、白藜芦醇、槲皮素、红景天提取物（RSAE）、迷迭香等。

牛精液冷冻技术与人工授精、体外授精、性别调控等现代动物繁殖技术有机结合，将对牛品种改良、保护优良种质资源、促进养牛业发展、拉动区域经济腾飞等发挥重要作用。因此进一步提高牛冷冻精液的质量，是我们研究的重点之一。

牛精液冷冻与人工授精技术相结合，在牛品种改良、保护优良种质资源中发挥着重要作用。随着畜牧业的蓬勃发展，冷冻精液在生产实践中的应用变得尤为重要，而冻后精液的质量则是重中之重。精液的冷冻保存技术一直被认为是动物育种的重要手段之一，在保护濒危物种及攻克男性不育方面做出了突出贡献。

精液的冷冻保存至今已有200多年的历史，早在1787年，生物学家Spallanzani第一次报道冷冻保存在冰雪中的人和马的精液解冻后仍有少量的精子存活。1938年，Janell发现储存于-79℃玻璃管中的精液，40天后复温部分精子仍具有活力。1940年，Shettles将精液置于毛细玻璃管中并放在-196℃储存，发现解冻后精子的存活率达到10%。但是直到1949年，Polge等将甘油用作哺乳动物精子、其他体细胞和组织的冷冻保护剂，低温冷冻技术才真正发展起来。1950年，英国的瑞丁动物人工授精研究中心，用牛冷冻精液进行人工授精后，成功地诞下牛犊，这是世界上第一个应用冷冻精液产生的哺乳动物。之后，各种动物精液的冷冻保存研究得到了蓬勃的发展并取得成功。

精液低温保存的原理是利用含有冷冻保护剂的稀释液将精子进行冷冻，使细胞的冰点降低，防止精子在冷冻过程中发生细胞严重脱水而导致冰晶形成，同时采取合适的降温速率，使精子顺利进入液氮的安全区。处于超低温状态下的精子代谢活动受到完全抑制，能量消耗停止，可以达到长期保存的目的，升温解冻后其受精能力恢复。标准化的精液冷冻程序如图1所示，包括精液采集、精液密度检测、精子活力检测、稀释罐装、冷冻和包装等部分。

精子的冷冻保存要经过降温、细胞脱水、冷冻、冻存以及解冻等一系列复杂的过程。精子细胞与体内其他细胞相比，水分含量低膜流动性高，耐冻能力更强，但是精液的冷冻-解冻过程引起精子膜结构与功能以及细胞代谢的改变，造成精子完整性受损。降温会引起精子细胞代谢紊乱、离子失衡、蛋白酶激活，造成细胞酸化毒性、能量消耗、膜的相变、胞质的不稳定、生成过量的自由基和活性氧；冷冻过程中，精子受到的损伤主要来自于胞内冰晶的形成、渗透压的升高、细胞的脱水以及蛋白质的变性。冷冻保存造成的精子损伤主要包括（图2）精子顶体完整性损伤、质膜完整性损伤、线粒体完整性损伤、氧化应激损伤以及遗传物质的损伤等。

提高冷冻精子质量的方法主要包括添加冷冻保护剂、优化冷冻方法以及添加抗氧化剂。精液冷冻稀释液的各种组分都是被系统研究过的，通常包括缓冲液（Tris碱）、一种或多种糖（葡萄糖、乳糖、棉子糖、蔗糖或海藻糖）、盐（柠檬酸钠、柠檬酸）、抗生素（青霉素、链霉素）以及冷冻保护剂。冷冻保护剂通常被分为渗透性冷冻保护剂（甘油、乙二醇、DMSO等）和非渗透性冷冻保护剂（牛奶、卵黄等）。目前常规精子冷冻技术主要包括慢速冷冻、快速冷冻以及可程序冷冻。最常用的是程序冷冻法，其简单易操作，但是设备价格昂贵，运行成本高。

在精液冷冻稀释液中补充抗氧化剂可改善冻后精子活力、膜完整性和可育性，是目前研究最多最有效的方法。抗氧化剂依据其化学结构可分为两类，即酶促和非酶促。酶促抗氧化剂包括GPX、SOD和CAT等。非酶类抗氧化剂主要是自由基清除剂，例如维生素E（α-生育酚）、维生素C（抗坏血酸）、褪黑素、GSH、牛磺酸以及酶促抗氧化剂的辅因子，例如硒或锌，形成抵抗自由基的防御系统。很多天然草药的提取物也可以用作抗氧化剂，例如金雀异黄素、白藜芦醇、槲皮素、红景天提取物（RSAE）、迷迭香等。

牛精液冷冻技术与人工授精、体外授精、性别调控等现代动物繁殖技术有机结合，将对牛品种改良、保护优良种质资源、促进养牛业发展、拉动区域经济腾飞等发挥重要作用。因此进一步提高牛冷冻精液的质量，是我们研究的重点之一。